[发明专利]一种提取棉花干种子基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种适用于棉花干种子基因组DNA的快速提取方法。

背景技术

棉花种子纯度的鉴定方法有棉花种子鉴定法（种子形态特征鉴定法、纤维平均长度鉴定法、纤维整齐度鉴定法、纤维长度变异系数鉴定法）、棉花幼苗形态特征鉴定法、棉花水溶性蛋白电泳鉴定法、田间小区种植鉴定法、田间检验及DNA分子标记鉴定法。传统的纯度鉴定是通过海南田间小区反季节种植鉴定和本地田间小区正季种植鉴定，前者可在农户播种之前知道种子纯度，虽然可以避免因种子不纯给农户造成的损失，但公司的损失已无可挽回（种子款已付给制种农户），而且海南鉴定结果准确性差，时间也偏晚，结果出来时，部分种子已卖到农户手中，难以收回。后者虽然结果准确，但时间晚，公司和购种农户的损失都已发生，不可避免，只能作为种子的后控措施。SSR分子检测技术可以在短时间内检测出转基因杂交棉种子纯度，速度快，准确性高，可有效防止制种农户掺杂使假。

应用SSR分子检测过程中，对基因组DNA高效、快速提取是基本环节。目前已有多种DNA提取方法，如SDS、CTAB等方法可提取高质量、高产量DNA。这些方法应用于SSR作物辅助育种或者杂交种纯度鉴定对大量样本进行分析时，要求基因组DNA提取人员操作熟练，整个过程步骤繁琐、耗时较长、试剂繁多且成本较高，另外对仪器设备有特殊要求等，这些缺点限制了其应用。

因此，为了及时准确地完成对大批量样本的SSR分子标记鉴定工作，必需建立简单、高效、稳定的DNA快速提取方法。

发明内容

本发明的目的是建立简单、高效、稳定的一种提取棉花干种子基因组DNA的方法。

本发明的一种提取棉花干种子基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)取棉花干种子胚于200μL96孔PCR板中；

2)向装有棉花干种子胚的PCR板的每个孔中加入50μL DNA提取缓冲液，然后于94℃保持15～20min；

3)弃上清，重复步骤2）一遍得到棉花干种子基因组DNA原液；

4)向装有棉花干种子胚和提取缓冲液的PCR板的每个孔中加入150μL ddH₂O稀释得到棉花干种子基因组DNA工作液；

前述的DNA提取方法，步骤1）所取棉花干种子胚可以为半胚或整胚，但是不能粘有胚以外的任何其他物质；

步骤2）中的提取缓冲液为100mmol/L Tris，pH值8.0；10mmol/L EDTA，pH值8.0；1mol/L KCl。

优选的，步骤2）中的提取缓冲液成分中100mmol/L Tris为100mmol/L Tris-Base，pH值8.0。

优选的，步骤2）中混合体系置于PCR扩增仪中进行反应。

优选的，步骤3）中去上清是指将96孔PCR板置于台式离心机3000rpm2min，待棉花干种子胚沉于PCR板底部，直接倒掉上清液。

优选的，步骤4）中向棉花干种子胚中加入150μLddH₂O稀释，便于后续的PCR产物扩增。

本发明至少具有以下优点：

（一）本发明所述的DNA提取方法不需要对样品进行研磨，同时省去了氯仿抽提蛋白质、异丙醇沉淀DNA、无水乙醇和75%乙醇洗涤DNA以及DNA的风干和溶解等步骤，省时、省力、省试剂且安全、无毒、无污染，是一种环境友好型的DNA提取方法。

（二）本发明所述的DNA提取方法采用96孔板装载反应物，提取过程仅需3步，试剂单一、操作简单，所有操作都在一块96孔PCR板中进行，具有高通量性，适用于大批量DNA提取的需要。

（三）本发明所述的DNA提取方法始终在一块PCR板中进行，提取过程中无需转换基因组DNA提取的器皿，避免了DNA提取过程中的交叉污染。

（四）本发明所述的DNA提取方法省去了常规方法提取中蛋白质抽提、DNA沉淀、洗涤、风干和溶解等步骤，同时也省去了多次上清液抽取和转移等步骤，避免了常规方法中因步骤繁琐而可能造成的DNA提取失败。

（五）本发明所述的DNA提取方法整个提取过程为高温、高盐环境，无RNA等杂质的污染，提取的基因组DNA质量较好，完全可以满足SSR-PCR分子标记分析的需要。

附图说明