[发明专利]一种具有溶栓活性的全蝎提取物

说明书

技术领域

本发明涉及中药分离领域，具体涉及具有溶栓活性的全蝎提取物。

背景技术

血栓性疾病严重影响着人类的健康和生命，是人类最主要的疾病之一。我国传统中医医书上记载着许多关于治疗血栓类疾病的药物。现代研究表明，从中药中提取的蛋白质治疗血栓性疾病，不容易出现免疫原性和过敏反应，减少副作用，如蚓激酶等。全蝎是钳蝎科动物东亚钳蝎Buthus martensii Karsch的干燥体，性辛，味平，有毒，具有归肝经，具有息风镇痉，攻毒散结，通络止痛的功效；主治“小儿惊风、抽搐痉挛、皮肤病、心脑血管病、炎症、乙肝、肿瘤”等病。若以全蝎粉末入药，存在着剂量大，易造成微生物污染等弊病。虽然，已经有人从全蝎中提取了活性成分，但是由于方法粗糙，提取物中存在着大量的杂质，易造成副作用、影响吸收及效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有溶栓活性的全蝎提取物，具有较强的纤溶活性和抗凝血活性，其提取方法去除了全蝎中大量的杂蛋白，活性成分的回收率高，纯化倍数高。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

具有溶栓活性的全蝎提取物，为分子量在1000-1500Da的小分子肽的混合物，采用如下方法制备：

（1）将全蝎用溶剂浸泡，粉碎，离心取上清液；将所述上清液超滤，取截留液采用硫酸铵沉淀法得到全蝎粗蛋白；

（2）将步骤（1）得到的全蝎粗蛋白采用酶水解得到酶解液；

（3）将步骤（2）所述酶解液依次经过阴离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相层析，取具有酰胺水解活性的洗脱液即得具有溶栓活性的全蝎提取物。

步骤（1）中所述超滤得到的截留液去除核酸后才用硫酸铵沉淀法得到全蝎粗蛋白。

所述截留液去除核酸的方法为：在截留液中加入聚乙烯亚胺，静置，离心取上清。

硫酸铵沉淀法具体为：在所述去除核酸的截留液中加入硫酸铵至饱和度为65%-75%，在0-4℃放置8-16h后，离心，取沉淀即得所述全蝎粗蛋白。

步骤（1）中所述超滤过程中超滤膜的截留分子量为5000-6000Da。

步骤（2）的具体方法为：将所述全蝎粗蛋白悬于人工胃液中，在36.5-37.5℃条件下水解4-6h后，离心取上清即得酶解液；所述人工胃液为：含有浓度为4000-8000U/ml的胃蛋白酶水溶液，pH为1.5-2.5。

所述阴离子交换层析中的介质DEAE-Sepharose FF。

所述凝胶过滤层析过程为：先采用Sephadex G-75凝胶过滤层析，然后采用Sephadex G-25凝胶过滤层析。

所述反相高效液相层析中使用的色谱柱为C18柱。

有益效果：

本发明具有溶栓活性的全蝎提取物，具有较强的纤溶活性和抗凝血活性，其提取方法去除了全蝎中大量的杂蛋白，得到的小肽分子量为1000-1500Da，活性成分的回收率高，纯化倍数高。

附图说明

图1 阴离子交换层析图谱。

图2 第一次Sephadex G-75凝胶层析图谱。

图3第二次Sephadex G-75凝胶层析图谱。

图4Sephadex G-25凝胶层析图谱。

图5 RP-HPLC层析图谱。

图6pH对全蝎提取物纤溶活性的影响。

图7温度对全蝎提取物纤溶活性的影响。

图8 纤维蛋白平板测定纤溶活性。

图9凝血酶对纤维蛋白原的降解产物的HPLC分析图谱。

图10全蝎提取物对纤维蛋白原降解产物的HPLC分析图谱。

图11全蝎提取物对纤维蛋白原的降解产物的SDS-PAGE凝胶电泳图谱，M泳道为蛋白Marker；1泳道为纤维蛋白原的三亚基，从上向下依次为Aα，Bβ，γ链；2-8泳道依次为纤维蛋白原分别降解5min，15min，30min，1h，2h，3h，4h的泳道。

具体实施方式

下述实施例中试剂的来源：聚乙烯亚胺（Alddin Chemistry Co.Ltd）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）；Tris碱、苯甲酞-DL-精氨酸-p-硝基酞替苯胺（BApNA）、苯甲磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）（国药集团化学试剂有限公司）；DEAE Sepharose FF(GE Healthcare)；Sephadex G-75, Sephadex G-25(Pharmacia)。