[发明专利]在Pichia pastoris中组成型表达菌丝霉素衍生物MP1102的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及利用组成型启动子P_GAP在重组毕赤酵母中高效表达菌丝霉素衍生物MP1102的方法。 

背景技术

菌丝霉素Plectasin是Mygind研究组利用从欧洲北部松林中分离出的腐生子囊类真菌Pseudoplectania nigrella构建cDNA文库，通过BLASTX和SSEARCHp序列相似性搜索程序，筛查到的具有高效抗G⁺菌活性抗菌肽。Plectasin基因编码含有95个氨基酸残基的多肽序列，其1-23是信号肽序列，24-55位为前导肽序列，56-95位为成熟肽（Plectasin）序列。Plectasin理论分子量为4407.9Da，具有六个组氨酸（His）和五个赖氨酸（Lys），在不同pH环境中，由于组氨酸解离状态不同，Plectasin的净电荷数在+1到+3之间变化(Mygind 等，Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus.Nature,2005,437(7061):975-980)。 

Plectasin对革兰氏阳性细菌具有强烈杀伤作用。Mygind等研究了Plectasin对130余株不同来源肺炎链球菌的抑制作用，发现对于青霉素敏感或抗性菌株，最小杀菌浓度（MIC）均在0.028-1.818μM之间，MIC₅₀为0.227μM。Gottlieb等（2008）研究Plectasin对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）杀菌能力，MIC值介于0.227和7.273μM，MIC₅₀为1.82μM(Gottlieb等，Antimicrobial peptides effectively kill a broad spectrum of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus strains independently of origin,sub-type,or virulence factor expression.BMC Microbiol,2008,8(1):205-214)。此外，Novozymes以Plectasin为母体，经易错PCR构建突变文库，从274个突变体中筛选到抗菌性 能大幅提高的突变体NZ2114，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离菌株平均MIC仅为0.227μM，并且对耐万古霉素肠球菌（VRSA）也具有很强的抑制作用，MIC值仅为0.455-0.91μM。此外，杀菌动力学实验证明，Plectasin具有高效杀菌能力，5×MIC Plectasin在5h内能够杀灭99.9%供试病原菌。小鼠腹腔感染模型显示，10mg/kg Plectasin5h内杀菌效率相当于70mg/kg万古霉素，腹腔中病原菌数量减少3个数量级（相当于99.9%杀菌效率）。7天后对照组小鼠全部死亡，按10mg/kg Plectasin给药的小鼠存活率依给药频度不同介于80-100%。NZ2114在兔心内膜炎感染模型中的治疗效果也得到相似结论，10mg/kg NZ2114即可大于或等于15mg/kg万古霉素或12mg/kg达托霉素疗效，3天后相关脏器（肾脏，脾脏）中病原菌的数量减少99%以上(Xiong等，Efficacy of NZ2114,a novel plectasin-derived cationic antimicrobial peptide antibiotic,in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2011,55(11):5325-5330)。