[发明专利]一种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属植物基因工程领域，具体涉及一种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用，特别是涉及所述基因在植物耐盐胁迫中的应用。

背景技术

山梨醇是一种糖醇，广泛分布于一些蔷薇科木本植物中。它是这些蔷薇科木本植物主要的光合产物、运输糖和贮藏物质，起着其它植物中蔗糖的作用。山梨醇还是一种小分子渗透物质，可以改变细胞渗透势，从而可以提高植物抗寒、抗旱、抗盐、抗硼亏缺等方面的能力。

山梨醇脱氢酶（sorbitoldehydrogenase，SDH）和山梨醇氧化酶（sorbitol oxidase，SOX）是参与山梨醇代谢的关键酶，其中SDH催化山梨醇转化成果糖与葡萄糖，SOX催化山梨醇氧化成葡萄糖。

在拟南芥中，韧皮部传送的主要碳水化合物是蔗糖以及少量的棉子糖，山梨醇在正常生长条件下并不会参与到拟南芥韧皮部糖类运输中。最近的研究表明，拟南芥SDH突变体经过干旱胁迫后，山梨醇含量有轻微的提升并且SDH的活性则会下降。鉴于山梨醇在植物抗逆胁迫中的重要作用，我们认为山梨醇脱氢酶可能能够对植物耐胁迫应用产生有利效果。

死海的含盐量极高，且越到湖底越甚。由于含盐量极高，水中只有细菌，没有其它动植物存在，人们称之为死海。嗜盐杆菌（Halobacterium）是生活在死海中的细菌之一，具有极强的耐盐能力。

发明内容

在本发明中，我们改造了一种来源于死海盐杆菌（Haloarcula marismortui）的山梨醇脱氢酶HmSDHI，并且利用基因攻城技术成功的将此基因转入到拟南芥中，并且经过一系列测试，为植物的耐盐胁迫提供一种解决的方案。

因此，本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因。

本发明所要解决的技术问题之二，在于提供所述的来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因在植物耐盐胁迫中的应用，即将该来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有提高植物耐盐性的的功能。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

所述的来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该山梨醇脱氢酶基因长1170bp，含1170个碱基，编码氨基酸387个。

所述的来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因，采用人工方法合成。即依照PTDS（PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS）方法克隆源自死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因（SDH），进行化学合成，在保持SDH基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本发明的山梨醇脱氢酶基因（HmSDH I）。

通过农杆菌介导将本发明的山梨醇脱氢酶HmSDHI转入拟南芥，可应用于植物耐盐胁迫。具体包括如下步骤：

1）HmSDH I农杆菌双元载体的构建

HmSDHI基因植物的双元载体是在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成的，在外源基因的表达单元内，我们在目的基因的两侧导入了BamHI和Sacl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由CAMV35S启动子控制。

2）电击法转化农杆菌

参照MicroPulser^TM Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide（BIO-RAD公司）制备农杆菌GV3101感受态，并且将构建好的农杆菌双元载体经电击法转入到农杆菌中。

3）农杆菌介导转化拟南芥

利用蘸花法将构建好的农杆菌转入拟南芥体内。首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3～5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22℃培养室，低光强度下生长24小时，即可正常培养。生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。

4）拟南芥转化植株种子的筛选

对上述得到的种子进行筛选，包括GUS组织化学染色分析和转基因阳性植株的PCR检测，即得到转入HmSDHI基因的拟南芥。

5）转基因拟南芥耐盐胁迫