[发明专利]一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法

说明书

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法。

背景技术

Dlk1基因（Delta-like homolog 1）位于Dlk1-Dio3印记域内，参与哺乳动物的脂肪积累及葡萄糖代谢过程。Dlk1基因也被称为脂肪前体因子1（Pref-1），其蛋白为跨膜糖蛋白，包含六个串联重复表皮生长因子样的胞外基序，结构类似Notch信号家族分子，但与Notch家族配体不同的是Dlk1的N端缺乏DSL（Delta：Serrate：Lin12）结构域，因而不能激活Notch信号的受体分子。体外内研究均表明Dlk1基因参与多个组织的分化，抑制脂肪的生成，可能作为Notch信号分子的拮抗物来参与Notch信号通路的调控。人体内缺乏Dlk1表达会导致肥胖；敲除Dlk1的转基因小鼠表现为中度肥胖，同时其体内脂肪含量增加30%，表明Dlk1基因可以抑制脂肪细胞的分化。

目前，研究发现在人、小鼠、牛和猪Dlk1基因中存在多种转录剪切体（A，B，C，C₂，D，D₂和E型），其中A型和B型剪切体编码具有抑制脂肪细胞分化功能的长链可溶蛋白；其它剪接体编码不具抑制功能的短链蛋白。另外，研究还发现Dlk1-C₂过量表达的转基因小鼠也会出现肌肉肥大。在猪多个组织中均有Dlk1-A，Dlk1-B和Dlk1-C₂表达，其中Dlk1-C₂表达量最高，推测在猪肌肉生长和脂肪沉积等方面发挥着重要的作用。目前在山羊上还未见有关Dlk1基因不同转录剪切体的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供山羊Dlk1基因的新转录剪切体、其扩增引物及扩增方法。

本发明所述的山羊Dlk1基因，有三种转录剪切体Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3，其核苷酸序列分别如SED ID NO.1，SED ID NO.2和SED ID NO.3所示。

本发明提供了用于扩增山羊Dlk1基因的两组扩增引物：

正向外引物Dlk1-1F的核苷酸序列如SED ID NO.4所示；

反向外引物Dlk1-1R的核苷酸序列如SED ID NO.5所示；

正向内引物Dlk1-2F的核苷酸序列如SED ID NO.6所示；

反向内引物Dlk1-2R的核苷酸序列如SED ID NO.7所示。

本发明还提供了一种扩增山羊Dlk1基因，包括三种转录剪切体Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3的方法，步骤如下：

步骤1：提取山羊肌肉组织的总RNA；

步骤2：从近缘物种人，小鼠，牛和猪Dlk1基因序列中分析保守序列，以此作为参考来设计所述引物组；

步骤3：以步骤1所得总RNA为模板，以所述的两组引物为引物，通过巢式PCR扩增获得山羊Dlk1基因的片段。

对所得序列用NCBI网站进行blastn在线分析，与Dlk1序列一致性最高的序列都是Dlk1在哺乳动物中的同源序列，可以确定所得序列为山羊Dlk1基因。

利用Clustalx V2.0软件对山羊Dlk1基因（包括三种转录剪切体Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3）的核苷酸序列进行比对分析并使用MEGA5.2软件构建NJ树。

本发明以山羊肌肉组织为材料，利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、巢式聚合酶链式反应（nested-PCR），对山羊Dlk1基因进行了研究，首次从山羊肌肉组织中克隆得到了Dlk1基因三种转录剪切体（Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3），并对其同源性和进化地位进行了分析，对研究山羊Dlk1基因不同转录剪切体在脂类代谢过程发挥的生物学功能具有重要意义。