[发明专利]枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因

说明书

技术领域

    本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因。

背景技术

植物生长在大自然时常遭受着各种非生物胁迫，随着世界环境的急剧变化这种非生物胁迫越来越严重。抗氧化酶是植物非生物胁迫中重要的防御系统，它们可通过降解的方法去除活性氧来抵抗非生物胁迫诱导产生的氧化伤害，从而减少对植物造成的伤害。但我们对抗氧化酶的功能及结构特性的认识仍很有限，还需要大量的工作。因此，克隆和鉴定植物中的具有抗氧化功能的基因，研究抗逆机制以及逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，可为充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础。

发明内容

    本发明旨在提供一种具有抗氧化功能的基因——枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因，其可作为目的基因导入植物，提高植物抗逆性，进行植物品种改良。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因，该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。

一种枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因编码的氨基酸，该氨基酸的序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

一种枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

一种枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因在提高植物抗旱性、耐盐性中的应用。

本发明从已经构建的壶瓶枣（Ziziphus jujuba Mill hupingzao）结果枝（即枣吊）cDNA文库中筛选到枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因的全序列，将其命名为Zj2-CP（Ziziphus jujube 2-cys peroxiredoxin）。生物信息学分析表明Zj2-CP基因的cDNA序列全长为834bp，编码277个氨基酸，分子量为30.65KD，理论等电点为8.95，CG含量为45.68%，不稳定系数为41.56，脂溶指数为87.29，疏水性平均值为-0.12。通过分析得出该基因编码的蛋白为膜外非分泌性蛋白，该基因编码的蛋白与已知物种2-半胱氨酸氧化还原酶基因编码蛋白的同源性为82%—99%。

根据枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因的cDNA编码的序列，设计带有限制性内切酶Sma I和Sal I酶切位点的特异性引物，Zj2-CP基因的上游引物W2的序列为：5'-ATAGTCGACAATGGCTTGCTCTG-3'，含有Sal I限制性酶切位点；Zj2-CP基因的下游引物W3的序列为：5'-ATCCCGGGTTATTGCTGCAAAG-3'，含有Sma I限制性酶切位点。设计的引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

经限制性内切酶Sma I和Sal I修饰后连接于植物表达载体PEZR(K)-LNY上，经过热激法将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，经卡那霉素抗性筛选获得阳性菌落，用碱裂解法提取阳性菌落质粒，经酶切，测序表明植物表达载体PEZR(K)-LNY-Zj2-CP构建成功。

通过冻融法将构建成功的重组质粒PEZR(K)-LNY-Zj2-CP转入农杆菌LBA4404的感受态细胞中，经卡那霉素抗性筛选获得阳性菌落，经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明工程菌PEZR(K)-LNY-Zj2-CP构建成功。农杆菌介导Zj2-CP基因转化拟南芥，经卡那霉素抗性筛选获得含有目的基因的转基因拟南芥植株，通过激光共聚焦观察分析表明枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因在转基因拟南芥的不同组织部位，根、茎、叶中均有不同程度的表达。

将转Zj2-CP基因拟南芥纯合株系的种子和野生型拟南芥种子均播种在加不同浓度NaCl的1/2MS培养基上，对转Zj2-CP基因拟南芥纯合株系的种子进行耐盐性评价，观察其生长状况，发现转Zj2-CP基因拟南芥植株在盐胁迫处理下长势和根系明显好于野生型拟南芥植株。将转Zj2-CP基因拟南芥植株和野生型（WT）拟南芥植株进行耐盐、耐旱胁迫处理，发现转Zj2-CP基因拟南芥植株耐盐、耐旱性明显提高。