[发明专利]表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒及应用，属于基因工程领域。

背景技术

小菜蛾属于鳞翅目菜蛾科，英文名：Diamondback moth；学名：Plutella xylostella (L.)，是世界性迁飞害虫，主要为害甘蓝、青花菜、白菜、油菜等十字花科植物。自1953年首次报道小菜蛾对DTT产生抗性以来，到目前为止，小菜蛾已对50多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性，几乎涉及到所有的防治用药。

精氨酸激酶（Arginine Kinase, AK）（ATP: Argine N-phosphotransferase EC 2.7.3.3）属于磷酸原激酶家族，广泛存在于无脊椎动物及软体动物中，类似于脊椎动物中的肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶(张元臣等. 烟夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析[J],昆虫学报, 54( 7) :754-761.）。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, 简称Bt）是一种分布广泛地革兰氏阳性芽孢杆菌，在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴胞晶体，且伴胞晶体（原毒素）对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有杀毒活性（Wight A P, Davis M E. Design and preparation of organic-inorganic hybrid catalysts[J]. Chem Rev, 2002,102(10): 3589-3614.），是目前应用最广泛，研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。虽然Bt杀虫剂具有对人畜安全无害、不污染环境，有一定的特异性和选择性的杀虫作用等优点，但也存在稳定性差、残效期短、杀虫谱窄等问题，严重影响了Bt的实际应用。这使得改造Bt成为一种必然。现阶段由于穿梭质粒载体、整合载体、Bt转座—解离载体等的成功构建，已经成功的将一些外源基因转入到苏云金芽孢杆菌中。但这些改造都集中在苏云金芽孢杆菌本身改造，特别是对其毒蛋白的改造。

RNA干扰（即RNAi）就是利用双链RNA（double strain RNA, dsRNA）介导相对应的基因的沉默（Geley, S., Muller C. RNAi: ancient mechanism with a promising future. Exp Gerontol, 2004, 39 (7): 985-998）。它的干扰机制是RNaseIII 核酶家族的成员Dicer酶特异性地与双链RNA结合并将其剪切成21~23 nt 大小的小分子RNA片段。双链的小分子RNA片段随后与RNA引起的沉默复合体(RNA- induced silencing complex, RISC)结合，解旋成单链，并在RISC的介导下与具有互补序列的mRNA结合，从而引起mRNA 的降解。通过注射和喂食dsRNA试验研究昆虫的功能基因，发现一些基因的沉默对昆虫的生长发育有显著的影响。因此，利用RNAi效应来抑制昆虫中必需基因的功能进而导致其死亡，以保护植物免受害虫的危害，这在理论上是可行的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可在苏云金芽孢杆菌中表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒，为小菜蛾的控制提供新途径。

本发明的质粒，是在质粒pHT305a的BamH I和Pst I酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的DNA得到的重组质粒，命名为质粒pHT305AKR。

本发明还保护了所述的质粒pHT305AKR构建的工程菌。

本发明还保护了所述的质粒pHT305AKR构建的苏云金芽孢杆菌工程菌。

本发明还保护了所述的苏云金芽孢杆菌工程菌在制备Bt生物杀虫剂中的应用。

详述如下：

所述的质粒pHT305AKR中，外源基因为小菜蛾精氨酸激酶部分基因，核苷酸序列具体如SEQ ID NO. 4所示。

所述的质粒pHT305AKR可在大肠杆菌中大量拷贝，可在苏云金芽孢杆菌菌株中表达。

用质粒pHT305AKR作为质粒构建的工程菌也属于本发明的保护范围。