[发明专利]一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质处理领域，具体涉及一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法。

背景技术

我国饲养的主要蜂种是生产能力极强的意大利蜜蜂，它具有极强的抗病能力和抗寒能力。蜂毒是由工蜂的毒腺和副腺分泌的一种液体，并储存在毒囊中。意大利蜜蜂蜂毒具有多种药理学活性和生物学活性，主要包括抗炎、降压、镇痛、抗病毒等作用，特别是对于治疗风湿、类风湿性关节炎、肩周炎、心血管疾病、肿瘤和多发性硬化等疾病具有较好的治疗效果（吉林科学技术出版社，2000，1-121）。为了能够全面了解蜂毒中所有低丰度蛋白质的相关信息，应尽可能多的提取全部蛋白质并避免蛋白质的丢失、减少杂质干扰，而且富集方法应具有良好的重现性。

近年来，蜂毒中高丰度蛋白质如蜂毒肽研究的较多，而蜂毒中更多种类的低丰度蛋白质及其类似物报道的较少。已有的蛋白质研究中主要集中于利用简单的沉淀蛋白质方法对研究对象中的全部蛋白质进行研究，但是由于没有去除高丰度蛋白质，造成了低丰度蛋白质被高丰度蛋白质掩盖，致使低丰度蛋白质被忽略而使其研究较少。

目前蛋白质提取方法主要包括超声波提取法、丙酮提取法和水溶液提取法。超声波提取法是将待分析物质置于超声波仪中，利用超声波的振动来提取或者沉淀其中所含的蛋白质，但是由于超声的温度、时间和频率不容易掌握，提取过程中容易造成蛋白质的变性和肽键的断裂。丙酮提取法是将待分析物质在0℃以下加入5-10倍量的冰丙酮（含β-巯基乙醇）同时迅速搅拌均匀，该方法沉淀的蛋白质不用经过脱盐处理，但是有机溶剂易使蛋白质或酶变性，而且使用大量的有机溶剂，对人体以及环境都有很大的毒害作用。由于大部分蛋白质或者多肽均易溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，所以水溶液提取法是常用的提取蛋白质方法，优点是蛋白质提取完全，损失少。

蜜蜂蜂毒中成分复杂，和其他生物组织相比，其蛋白质含量超过蜂毒干重的75%，而且分子量（2000Da-45000Da）覆盖范围较大。在已有的蜂毒中蛋白质富集方法研究中，常用的方法是凝胶过滤法和凝胶渗透层析法，只有通过多次利用不同规格型号的凝胶颗粒才能对不同分子量大小的蛋白质进行粗分离。这两种方法作为传统的蛋白质分离和净化方法其最大的缺点是分离过程繁琐，提取和净化过程中损失很多蛋白质导致蛋白质丢失，从而使一些具有特定生物学功能的蛋白质未被发现和研究；此外，繁琐的试验过程导致方法的重现性差，在实验室建立的方法很难应用于实际生产。这些都是传统的分离富集方法难以克服的技术困难。

发明内容

为了开发一种新型的蜜蜂蜂毒中蛋白质的富集方法，本发明的目的是提供一种蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法。

本发明提供的蜜蜂蜂毒中低丰度蛋白质的富集方法为：以键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠为吸附基体，与蜜蜂蜂毒进行混合以吸附其中的蛋白质，然后采用PBS缓冲溶液洗涤以除去过量的高丰度蛋白质，最后用洗脱液将所述吸附基体上吸附的蛋白质进行洗脱得低丰度蛋白质富集后的洗脱液。

本发明技术方案利用了微珠固相萃取法，基于在多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒表面通过短的连接臂键合含有20种天然氨基酸的六肽配体作为吸附不同丰度蛋白质的吸附基体。当一个包含不同丰度蛋白质的复杂混合溶液与整个吸附基体的配基进行孵育时，每种蛋白质都可以至少与一个配体进行结合。在过量蛋白质混合物上样的情况下，高丰度蛋白质很快能与它们特异性结合的亲和配体达到饱和，过量部分在后续洗涤阶段被洗去。相反，低丰度蛋白可以继续浓缩在特异性结合的亲和配基上。经过吸附与洗涤处理之后，再用洗脱液将所有特异性结合的蛋白质从所述吸附基体上洗脱下来，形成丰度差别显著减少的蛋白质混合物，从而实现低丰度蛋白质的富集。

上述富集方法中，所述吸附基体和蜜蜂蜂毒的重量比为0.1～1∶1。

优选地，所述吸附基体和蜜蜂蜂毒的重量比为0.3～0.5∶1。

上述富集方法中，所述吸附基体与蜜蜂蜂毒进行混合前，依次用水和PBS缓冲溶液进行洗涤。

上述富集方法中，所述富集方法还包括：在洗脱步骤之前用水洗涤所述吸附基体以除去蛋白质中的盐。

上述富集方法中，所述洗脱步骤中用pH值为2.0～2.5的甲酸或乙酸溶液作为洗脱液；优选用0.1～0.5M的甲酸溶液作为洗脱液。

上述富集方法中，所述蜜蜂蜂毒为意大利蜜蜂的蜂毒。

本发明的富集方法优选包括以下步骤：

（1）将键合多孔聚羟甲基丙烯酸酯颗粒的六肽配体微珠依次用2～5倍重量的纯水和PBS缓冲溶液各洗涤1～3次；