[发明专利]用分子印迹电化学发光传感器检测微量赤霉素A3的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用分子印迹技术、罗丹明B放大效应与电化学发光传感器联用快速测定微量赤霉素的方法。

背景技术

赤霉素（Gibberellin，GA）是一类非常重要的植物荷尔蒙，在农业生产上得到了广泛的应用。赤霉素对植物生长、发育的各个阶段起着调节作用，对蔬菜水果等有着显著的增产效果。不同的赤霉素生物活性不同，而赤霉素A3（GA3）的活性最高。但是，有研究表明，在长期使用后赤霉素可能在人体中富集积累，引起慢性中毒，甚至癌变，对人类健康造成安全隐患。目前，一些发达国家已经对水果、蔬菜以及啤酒中的赤霉素最高残留限量做出了严格规定。因此，寻找一种快捷、方便、高灵敏、低检出限的检测痕量赤霉素的方法具有重要意义。分子印迹近年来兴起的分子特异性识别技术。而电化学发光检测手段具有许多电化学不具备的优势，将分子印迹技术与电化学发光技术结合起来，可以得到高灵敏度、高选择性的生物传感器，目前已经有相关报道，但是应用于微量赤霉素的检测暂未有相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度、高选择性且区别于酶放大的罗丹明B标记放大效应,并可以对微量赤霉素进行测定的分子印迹电化学发光传感器。

构思如下：在罗丹明B存在的条件下，由于鲁米诺和罗丹明B在一定的电压下，均会发生氧化反应，生成氧化态的中间产物。在一定的电压下和介质中，罗丹明B的中间氧化态产物能够还原溶液中的溶解氧生成超氧基阴离子（O₂^-），鲁米诺发光前体被超氧基阴离子（O₂^-)进一步氧化为激发态的3-氨基邻苯二甲酸根离子(ATP^-)^*，即发光体，发光体在返回基态的弛豫过程中释放出光子，产生较强的化学发光。所以，罗丹明B在体系中能够极大地增强鲁米诺激发态中间产物的微弱电化学发光信号。此外，引入了罗丹明B标记放大，代替了成本较高的酶，很好的提高了灵敏度和降低了检测成本。电化学发光信号的改变即是通过待测液中的赤霉素A3竞争取代分子印迹膜上已孵化上的罗丹明B标记的赤霉素A3来达到的。待测液中的赤霉素A3浓度越大，竞争能力越强，使得电极表面的罗丹明B标记的赤霉素A3量减少，即罗丹明B与底液中鲁米诺的反应量减少，产生的发光中间体减少，从而检测到电化学发光信号减弱，这样即可达到间接地检测赤霉素A3的目的。

本发明涉及罗丹明B标记放大效应的分子印迹技术电化学发光增敏技术。当待测分子赤霉素A3与电极表面的分子印迹膜上罗丹明B标记的赤霉素A3进行竞争取代时，罗丹明B与底液中的鲁米诺在金电极上的电化学发光信号发生变化，电化学发光强度变化与待测赤霉素A3的浓度在1×10^-11 ~ 3×10^-9 mol/L范围内呈良好的线性关系。

具体步骤如下：

（1）金电极的处理：

依次用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉将金电极抛光后，分别在无水乙醇和水中各超声洗涤5分钟，然后在0.5 mol/L H₂SO₄中于-0.2 ~ 1.0 V进行循环伏安(CV)电化学处理，直到获得稳定的CV响应。

（2）赤霉素A3分子印迹电化学发光传感器的制备：

先将0.009 ~ 0.036g邻苯二胺用10 mLpH=5.2的醋酸缓冲液溶解，然后加入2×10^-4 ~ 8×10^-4 mol/L的赤霉素A3(GA3)溶液，充分混合均匀，用循环伏安法扫描20 ~ 40圈，扫描范围-0.2 ~ 1.0V，扫速50 mV/s；聚合完成后将金电极取出，用二次蒸馏水冲洗干净后，放入体积比为7 ~ 9:1的无水甲醇-冰醋酸体系中，在搅拌下洗涤金电极表面的聚合膜5 ~15分钟，除去聚合物膜中的赤霉素A3以及吸附在分子印迹膜上的其它吸附物，制成保留有模板分子构型孔穴的赤霉素A3分子印迹电化学发光传感器；

（3）检测方法：