[发明专利]一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，尤其涉及一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法。

背景技术

植物组织培养包括器官培养、愈伤组织培养、茎尖组织培养、细胞培养、原生质体培养等。其中愈伤组织培养最常见，因为除茎尖分生组织培养和少数器官培养外，其它类型都要经历愈伤组织阶段才能产生再生植株，其原理是利用植物细胞的全能性，愈伤组织的形成在组织培养技术中有着至关重要的地位，许多药用植物中的活性成分可直接通过愈伤组织进行合成。

珊瑚菜是生长在北太平洋沿海地区沙滩地的一种伞形科多年生草药。在我国分布于辽宁、山东、江苏等地，生长于海边沙滩或人工栽培，原为海滩沙生植物群落的建群种之一，对海岸固沙和盐碱土改良具重要作用，但随着海滩的滥用开发和对该植物的过度采挖，使其数量日趋减少，已经处于濒临灭绝的境地，被列为中国珍稀濒危保护植物。而人工栽培技术要求高，种子萌发率低，生长周期长，掠夺式的采集野生资源又会危及生态平衡。珊瑚菜具有较高的药用价值，其根状茎和根可作生药，被收入日本和中国药典。珊瑚菜根（北沙参）中含有多种香豆素和香豆素苷，主要有欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、佛手素、花椒毒酚、花椒毒素、补骨脂素、东莨菪素、紫花前胡苷元等。其中补骨脂素、欧前胡素和异欧前胡素三种香豆素的含量可作为评价北沙参不同部位质量及产地加工方法的标准。研究表明，北沙参在体内具有抗癌作用的主要活性成分为呋喃香豆素，其中浓度为50μg/mL的欧前胡素和异欧前胡素抑制活性最强。

大多数药用植物的根不仅可提供生物药学成分，而且也是农药、风味调料、染料和香料的重要来源，而根中的有效成分是植物的次级代谢产物，具有较高的应用价值，因此利用根的体外培养生产次级代谢产物越来越受到学者们的关注。毛状根培养技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术，目前美国、英国、加拿大、日本、中国及韩国都在对药用植物毛状根的诱导培养进行着大量的基础研究，研究表明，毛状根具有细胞培养和一般器官培养所不能兼备的特点，几乎所有双子叶植物中由根部合成的次级代谢物质都可以通过毛状根来生产，这一生物技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径，日益引起人们的关注。

利用发根农杆菌感染诱导药用植物形成毛状根，并对毛状根进行离体培养增殖，是对药用资源植物可持续利用的有效途径之一。毛状根具有生长速度快、培养增殖不需要加入激素、分化程度高、产生次生代谢产物的能力强、可以通过基因工程的手段来增加次生代谢产物的含量、并能够合成某些悬浮细胞培养所不能合成的次生代谢产物等优点，越来越受诸多专家研究者的重视。但是目前对于珊瑚菜活性物质的诱导及生产还处于利用常规组织培养及细胞培养手段的水平，关于珊瑚菜毛状根的诱导尚未有人研究。

发明内容

本发明提供了一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，利用本发明所述方法诱导的珊瑚菜毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等特点，可用于工业化生产珊瑚菜香豆素。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，它包括以下步骤：

（1）获得珊瑚菜无菌苗；

（2）培养供感染用的发根农杆菌；

（3）转化外植体进行共培养：取长势较好的珊瑚菜无菌苗，切取根、叶柄或叶片作为外植体，在其表面划出伤口用于感染，放入发根农杆菌菌液中浸泡，然后放入MS固体培养基中共培养，直至外植体周边出现菌斑；

（4）诱导毛状根发生：将出现菌斑的外植体清洗后，放入含有头孢噻肟钠的1/2MS培养基中培养，定期更换1/2MS培养基，在更换的培养基中逐步降低头孢噻肟钠的浓度，直到在完全除掉头孢噻肟钠的1/2MS培养基中继续培养，获得除菌的毛根系；

（5）毛状根的培养增殖：将除菌完全、生长快速的毛状根接种在1/2MS液体培养基中，振荡培养增殖，获得大量毛状根。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）中选择饱满的珊瑚菜种子，灭菌，后接种于MS固体培养基中培养获得无菌苗。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2）中所用菌种为发根农杆菌1.2556。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2）中发根农杆菌的感染菌液最佳浓度为OD₆₀₀=0.08。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中所述外植体优选为无菌苗的根，其次为叶柄，再次为叶片。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中珊瑚菜无菌苗放入发根农杆菌菌液中浸泡15-30min。