[发明专利]诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法。

背景技术

目前修复软骨组织的传统方法是采用自体软骨细胞，此法必须在关节镜下切取非负重区的关节软骨，对其中的软骨细胞进行扩增，这种手术唯一的优点为无抗原性，但造成机体损伤很大。另外软骨组织中绝大部分为基质，软骨细胞数量少且难分离，体外传代次数有限，一般最多培养3～4代，所以难以获得大量细胞。

当前，骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞普遍采取高密度聚团诱导。该方法一般将扩增后的细胞离心成细胞团，再用成软骨细胞诱导培养基进行微团诱导。但是成软骨细胞诱导需要大量的骨髓间充质干细胞，为了获得大量的骨髓间充质干细胞，必须在体外进行长时间的传代培养，而随着细胞培养时间的延长，干细胞的多向分化潜能会出现程序性丢失，消化过程中使用的胰酶也会导致细胞活性的降低。

间充质干细胞（MSCs）是成体干细胞的一种，它具有多向分化潜能，为类风湿性关节炎，骨关节炎及先天性软骨发育不良等疾病的细胞治疗开辟了一条新的途径。并且最新研究表明，MSCs可以作用于抑制患者自身的炎症反应，以及缓解一些退行性疾病的症状。

目前采用MSCs分化成软骨细胞的方法一般是将MSCs培养至传代的MSCs后，再在含有定向诱导为软骨细胞的因子的培养基中进行诱导培养，将MSCs诱导成软骨细胞。但是由于MSCs的定向诱导分化受很多不同信号通路的影响，而且诱导培养MSCs的细胞微环境变化对于MSCs诱导分化及其分子结构有着非常重要的影响。因此。导致现有的MSCs分化成软骨细胞的方法所需周期都较长，通常需要2-4周，并且诱导后II型胶原的表达效率较低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种诱导时间短、诱导后II型胶原的表达效率高的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，包括如下步骤：

获取间充质干细胞和软骨细胞；

将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养；

将所述间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中，再将接种有所述间充质干细胞的所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中，并将所述软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养；其中，所述软骨细胞诱导分化培养基中含有2×10^-7～5×10^-7mol/L的甲状旁腺激素相关蛋白1-34。

上述诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法采用插入式培养皿共同培养软骨细胞和间充质干细胞，使两种细胞可以模拟体内环境而发生协同作用，利用诱导MSCs分化成软骨细胞因子与软骨细胞分泌的细胞外基质作诱导因子的协同作用，从而显著的缩短了诱导MSCs分化成软骨细胞的时间，提高了软骨细胞增殖率，并且同时提高了诱导分化后细胞的II型胶原的表达率与表达量，诱导分化后细胞的糖胺聚糖（GAG）的分泌也得到了明显提高。另外，MSCs与软骨细胞通过插入式培养皿而分隔开生长，有效的避免两细胞间的交叉污染，保证两细胞的纯度，从而利用MSCs的诱导和软骨细胞的增值。

附图说明

图1是本发明实施例诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法工艺流程示意图；

图2是本发明实施例1的步骤S11中分离培养的MSCs的流式检测结果分析图；其中，图2A为传代培MSCs的CD29、CD34、CD44和CD45表达率柱状图，图2B为MSCs的CD29表达率图，图2C为MSCs的CD34表达率图，图2D为MSCs的CD44表达率图，图2E为MSCs的CD45表达率图；

图3是本发明实施例1与对比实例1中MSCs诱导分化为软骨细胞中的阳性表达II型胶原细胞的流式检测图；其中，图3A为实施例1与对比实例1分别诱导第5和第8天时，MSCs诱导分化为软骨细胞中阳性表达II型胶原的细胞所占比率的柱状图；图3B为实施例1中的MSCs诱导5天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图；图3C为对比实例1中的MSCs诱导5天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图；图3D为实施例1中的MSCs诱导8天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图;图3E为对比实例1中的MSCs诱导8天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图；

图4是本发明实施例1、对比实例1中的MSCs分别诱导5天和8天后以及对比实例2中的MSCs中的阳性表达II型胶原的细胞的荧光表达测定结果图；