[发明专利]白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及快速检测白色念珠菌的试剂盒及方法和应用。 

背景技术

白色念珠菌（candida albicans）是念珠菌属（假丝酵母属）中最为常见的种。也是临床上浅部/深部真菌病中发病率最高的念珠菌病的重要病原菌。由于该菌多侵犯已患有严重疾病机体免疫力低下的病人，以及接受器官移植，实施心脏、胃肠道手术需行插管、尿管、导管的外科病人，对生命威胁极大，为及早发现与诊断念珠菌感染，快速、简便、特异及准确达到临床分离和鉴定念珠菌的方法一直受到国内外的广泛关注。随着免疫受损或低下人群的不断扩大，机会性念珠菌病继续增多，迄今仍是医学真菌领域研究的热点。 

目前国内外白色念珠菌主要的检测方法有传统的微生物检测方法和分子生物学检测方法。微生物方法检测白色念珠菌主要用到科玛嘉显色培养基进行分离鉴别，要求检测人员有较丰富的经验，进口的培养基检测成本也高。分子生物学检测主要使用PCR及RT-PCR等方法，普通的PCR技术其扩增产物大多通过凝胶电泳判断扩增结果，该方法中的致癌物质不仅对环境和操作人员有很大的危害，而且要求检测人员具备熟练的操作技巧，点样时操作误差会使样品漂移造成结果不准确，不适合进行大量样本的检测分析工作；RT-PCR方法需要购买高端的仪器设备，并且试剂价格昂贵，这些都给检测带来了巨大的成本压力。 

发明内容

本发明解决的技术问题是提供白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用；发明主要目的在于克服传统的微生物检测方法存在检测时间长、步骤繁琐等缺陷，提供一种更加快速、简捷、安全的检测试剂盒及其检测方法。 

本发明设计试剂盒即可以保证PCR技术的灵敏度和特异性，还保留了免疫层析技术所具备的高效、便捷、低成本等特点。 

所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，包括PCR反应液、样品稀释液、阴性对照、阳性对照和试纸条，所述试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成。所述结合垫上包被胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜上有包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线；所述PCR反应液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物 F为5’TTGGTGGTGGTAGACATAGA 3'，下游引物R为5'TCAGAACACTGAATCGAAAG 3'；所述上游引物F标记生物素，下游引物R标记地高辛。 

所述结合垫上包被的胶体金颗粒粒径为25nm，1mL胶体金颗粒标记8.4μg鼠抗地高辛抗体，形成的胶体金-抗体复合物在结合点垫上的包被量为2mL/30cm。 

所述硝酸纤维素膜上检测线包被亲和素浓度为0.5mg/mL，包被量为1μL/cm；控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。 

PCR反应液组成如下：23μL反应体系包括以下组分 

阴性对照：热带念珠菌； 

阴性对照制备方法：热带念珠菌培养过夜后，作为阴性对照品； 

阳性对照：白色念珠菌； 

阳性对照制备方法：白色念珠菌培养过夜后，作为阳性对照品； 

样品稀释液：PBS溶液(pH7.2)组成为 

氯化钠            8.5g 

氯化钾            2g 

十二水磷酸氢二钠  2.9g 

二水磷酸二氢钠    0.3g 

纯水              1000mL 

PCR反应液、阴性对照、阳性对照储存于－20℃。 

样品稀释液和试纸条常温储存于阴凉干燥处。 

所述试纸条外部设置塑料卡盒，塑料卡盒上依次设置凹孔和观测口，所述试纸条的样品垫放置于凹孔对应处，硝酸纤维素膜上设置的质控线和检测线在观测口对应处； 

应用本发明试剂盒检测样品中白色念珠菌的方法，包括以下步骤： 

1）取出含有PCR反应液的反应管，待溶化后2000转/分离心30秒； 

2）向反应液管中加入2μL样品DNA，混匀； 

3）将上述反应管置于普通PCR仪中，95℃变性3min后，95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行30个循环，之后72℃延伸10min，完成PCR扩增； 

4）将上述10μL的扩增产物与90μL的样品稀释液进行混合； 

5）取出试纸条平放于水平桌面上，将上述混合液加在试纸条样品孔中；