[发明专利]一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法

权利要求书

1.一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，所述博来霉素族衍生物为6’-脱羟基-BLM S，其特征是，具体步骤为：

1）黄绿链霉菌SB9026的发酵培养：

将黄绿链霉菌SB9026菌株接种至种子培养基中培养，在25°C-35℃下培养1-3天；再取所述种子培养基转接到发酵培养基中培养，接种量为8%-12%，在25°C-35℃下培养9-10天；所述种子培养基为：12g/L-17g/L甘油、12g/L-17g/L棉籽粉、2.5g/L-3.5g/L NaCl和4.5g/L-5.5g/L蛋白胨，其余为水，pH值为6.8-7.2；所述发酵培养基为：18g/L-22g/L葡萄糖，12g/L-17g/L可溶性淀粉，18g/L-22g/L黄豆粉，4.5g/L-5.5g/L酵母粉，0.08g/L-0.12g/L CuSO₄·5H₂O，0.48g/L-0.52g/L ZnSO₄·7H₂O和2.5g/L-3.5g/L CaCO₃，其余为水，pH为6.8-7.2；其中黄绿链霉菌SB9026的保藏号为CCTCC M 2011292；

2)发酵罐发酵制备博来霉素族衍生物：

采取逐级放大的方式将所述发酵培养基转接至发酵罐中发酵培养；所述发酵罐培养时采取梯度降温模式，初始温度为32°C，当发酵罐培养至20-26小时降温至30℃；当发酵罐培养至55-65小时时降温至28°C，继续发酵培养115-125小时；在发酵培养过程中对微生物的生长和次代谢产物的合成进行控制，同时通过在线监测pH值和溶氧值，使发酵液中残糖浓度维持在0.8g/L-1.2g/L，同时pH值维持在7.5以下，溶氧维持在40%-60%，发酵周期为6-12天；6’-脱羟基-BLM S在发酵液中的产量达30mg/L以上。

2.根据权利要求1所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，在步骤1）发酵培养之前先对黄绿链霉菌SB9026进行涂布培养，筛选高产菌株。

3.根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤1）为：将黄绿链霉菌SB9026菌株接种至种子培养基中培养，在30℃下培养2天；再取所述种子培养基转接到发酵培养基中培养，接种量为10%，在30°C下培养12天；所述种子培养基为：15gL甘油、15g/L棉籽粉、3g/L NaCl和5g/L蛋白胨，其余为水，pH值为7.0；所述发酵培养基为：20g/L葡萄糖，15g/L可溶性淀粉，20g/L黄豆粉，5g/L酵母粉，0.1g/L CuSO₄·5H₂O，0.5g/L ZnSO₄·7H₂O和3g/L CaCO₃，其余为水，pH值为7.0。

4.根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤2）中所述逐级放大的方式具体为：先将300μl黄绿链霉重组工程菌SB9026的孢子悬浮液接种到60ml种子培养基中进行第一级放大，在32°C下培养24小时后转至600ml发酵培养基中进行第二级放大，并在32°C再次培养24-36小时直至菌丝体密度达到肉眼可见密集程度；随后将所述600ml发酵培养基转接至装有6L发酵培养基的15L发酵罐中进行发酵培养。

5.根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤2）中发酵罐培养的具体方法为：当发酵罐的容积为12L-20L时，发酵罐开始培养时，初始温度为32°C；初始pH值为6.8；设置发酵罐溶氧值与转速为联动状态，溶氧的下限值为30%，转速范围为210rpm-400rpm；当发酵罐培养至20-26小时，设置发酵罐溶氧值与转速为联动状态，将培养温度降低至30°C；当发酵罐培养至55-65小时，发酵液溶氧值跌至最低，转速在最高值运转，此时将培养温度进一步降低至28°C；在发酵培养后期约115-125小时，发酵液溶氧值和pH值开始上升时，开始补加葡萄糖溶液，并实时测定发酵液中残留的还原糖浓度，通过调节补料的频率和速度以及葡萄糖溶液的浓度，使发酵液中残糖浓度维持在1g/L，同时pH值维持在7.5以下，溶氧在40%-60%；当发酵罐维持补充葡萄糖2-3天，溶氧和pH值开始进一步上升，此时整个发酵周期结束。