[发明专利]一种基于单核苷酸多态性标记的互花米草遗传分型方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于单核苷酸多态性标记的互花米草遗传分型方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。

组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，单核苷酸多态性标记可帮助区分个体间遗传物质的差异。

随着单核苷酸多态性标记技术的成熟及其在分子生态学中的广泛应用，外来物种入侵机理日益成为国际上研究的重点。大量的研究表明外来入侵种能在如此短的时间内迅速地做出适应性的进化，可能与其自身的遗传结构密切相关。因而，在外来入侵物种上，亟需一种能够有效揭示外来入侵物种遗传本质的方法。

互花米草（Spartina alterniflora）是一种原产北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陆和消浪护堤作用显著而被许多国家引种。1979年，南京大学从美国东南部的北卡罗莱纳、乔治亚和佛罗里达引种了3种不同生态型互花米草至福建罗源湾，随后扩大分布至我国海岸潮间带辽宁丹东以南的广大区域，并取得了一定的生态和经济效益。但作为外来物种，其强大的繁殖能力和高大密集的种群特征，对我国沿海滩涂地区的生态系统、生物多样性和水产养殖产生了较大的负面影响，2003年被环保总局列入我国第一批16种外来入侵物种名单。因此，对其入侵过程和扩张机制的研究已刻不容缓。本发明以列入中国首批外来入侵物种的互花米草为对象，在整个基因组内批量寻找多态性位点，全面评估互花米草的多样性，并揭示其遗传本质和入侵机制，为进一步研究和控制互花米草等相关物种提供有力的技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于单核苷酸多态性标记的互花米草遗传分型方法，能够在基因组序列信息较少的情况下，获得大量的核苷酸多态性标记，发现引入的不同互花米草种群之间存在的遗传变异，为揭示其遗传本质和入侵机制，进一步研究和控制互花米草提供有力的技术支持。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法，步骤如下：

1)种群调查及取样；

2)DNA提取；

3)测序；

4)筛选目标基因R59；

5)根据目标基因R59设计引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO：1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO：2所示；

6)PCR扩增；

7)测序；

8)序列拼接、比对，鉴定记录单核苷酸多态性位点。

进一步地，所述目标基因R59是通过高通量转录组测序后筛选得到。

进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃30s、54℃30s、72℃1.5min，38个循环，72℃延伸10min。

进一步地，所述目标基因R59在互花米草种群中有7个单核苷酸多态性位点，目标基因R59基因片段如序列表中SEQ ID NO：3所示，其中7个单核苷酸多态性位点分别位于93、347、436、536、555、683、684。

进一步地，高通量转录组测序的方法：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度约为500bp,在illumina HiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行拼接，从而得到基因序列。