[发明专利]一种利用SSR分子标记对五节芒与荻杂交种进行快速鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物杂交种鉴定技术领域，具体涉及一种芒属植物杂交种分子鉴定方法。

背景技术

芒属植物（Miscanthus）为禾本科、多年生高大草本C4植物，作为最具发展潜力的能源植物日益受到关注。中国是芒属植物的起源与分布中心，具有丰富的野生资源、生态类型多。芒属植物适应性广、抗逆性强、产量高、净能产出高、生物质品质好、转化利用途径广、生态价值好等特点，适合在边际土地上种植利用，是一种兼具生态效益与经济效益的草本能源植物。芒属植物中的荻（Miscanthus Sacchariflorus）在我国东北、西北、华北及华东均有分布，抗逆性强，自然衰老，在耐盐碱方面表现显著，可作为改良盐碱的先锋植物，但生物质产量较低。五节芒（Miscanthus Floridulus）分布于长江中下游及以南区域，具有植株高大，生物质产量高，其茎及叶可为造纸原料，叶幼嫩时可做饲料，但抗旱、耐寒能力较弱，且不能自然衰老等特点。作为能源植物必须具备高生物质产量、高环境适应能力、低生产成本和产品的低含水量等特性，因此荻和五节芒单独作为能源植物的利用价值不大。开展五节芒和荻作的人工杂交研究，是利用荻和五节芒的各自优良性状，培育出抗逆性强、高产、广适应性等综合性状优良新品种的最佳途径。

在我们前期的研究中发现芒属植物的自交结实率在不同基因型芒属植物中存在较大的差异，因此有可能在杂交种后代中存在自交苗，必须要准确的鉴定真假杂交种植株，避免在遗传分析和育种选择中出现误差。形态学性状是杂交种鉴定的基础，尤其一些父本所特有的性状在杂种中的表现,是鉴别杂交种的重要形态学标记，但其鉴定耗时长，占用大量土地资源，形态学性状受环境影响等，不利于杂交种的快速鉴定。本发明方法利用SSR分子标记对芒属植物五节芒与荻人工杂交种真实性进行鉴定，具有快速、准确、重复性好，不受环境因素影响等优点，为开展芒属植物分子育种奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效快速的五节芒与荻杂交种的鉴定方法，该方法操作简便、具有快速、重复性好、不受环境因素影响、鉴定结果准确可靠，非常适合五节芒与荻杂交种群体的早期鉴定。

本发明的目的是通过下述方式实现的：

一种利用SSR分子标记对五节芒与荻杂交种进行快速鉴定的方法，包括以下步骤：

1）基因组DNA的提取

待测的五节芒与荻杂交种植株提取DNA；

2）SSR-PCR反应

加入HAU-170号引物进行SSR-PCR，引物序列如下：

正向引物序列:5'-TGCATGGTTGCTTCAGCAGT-3',

反向引物序列:5'-ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3'；

3）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR反应产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；

4）银染和条带分析。

步骤1）的具体过程为：

待测的五节芒与荻杂交种植株长到4-5叶时，采用CTAB法提取叶片DNA，所提取的DNA溶解于pH8.0的TE溶液中，4℃保存备用。

步骤2）的SSR-PCR反应体系为：

PCR反应体积为15μL，其中包括：10×Buffer1.5μL，25mmol·L^-1的MgCl₂1.5μL，10mmol·L^-1的dNTPs0.3μL，5U·μL^-1的Taq聚合酶0.1μL，20-25ng.μL^-1的DNA模板2μL，2μmol·L^-1的引物1.5μL，超纯水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性30s，54℃退火温度下复性30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min后4℃保存。

步骤3）的具体过程为：

PCR产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测，用1×TBE作为电泳缓冲液；在SSR-PCR产物体系中加入2μL的6×上样缓冲液混合，加入2μL至点样孔中，电泳2小时。

步骤4）的具体过程为：

固定：将电泳完的凝胶放入400mL的固定液中固定5min，然后用蒸馏水清洗一次；

银染：在400mL的银染液中银染12min,然后用蒸馏水清洗一次；

清底：在400mL的硫代硫酸钠溶液里面洗30s，变黄倒掉，用蒸馏水清洗一次；