[发明专利]一种利用SSR分子标记对五节芒与荻杂交种进行快速鉴定的方法

权利要求书

1.一种利用SSR分子标记对五节芒与荻杂交种进行快速鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）基因组DNA的提取

待测的五节芒与荻杂交种植株提取DNA；

2）SSR-PCR反应

加入HAU-170号引物进行SSR-PCR，引物序列如下：

正向引物序列:5'-TGCATGGTTGCTTCAGCAGT-3',

反向引物序列:5'-ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3'；

3）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR反应产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；

4）银染和条带分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤1）的具体过程为：

待测的五节芒与荻杂交种植株长到4-5叶时，采用CTAB法提取叶片DNA，所提取的DNA溶解于pH8.0的TE溶液中，4℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤2）的SSR-PCR反应体系为：

PCR反应体积为15μL，其中包括：10×Buffer1.5μL，25mmol·L^-1的MgCl₂1.5μL，10mmol·L^-1的dNTPs0.3μL，5U·μL^-1的Taq聚合酶0.1μL，20-25ng.μL^-1的DNA模板2μL，2μmol·L^-1的引物1.5μL，超纯水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，35个循环：94℃变性30s，54℃退火温度下复性30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min后4℃保存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤3）的具体过程为：

PCR产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测，用1×TBE作为电泳缓冲液；在SSR-PCR产物体系中加入2μL的6×上样缓冲液混合，加入2μL至点样孔中，电泳2小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤4）的具体过程为：

固定：将电泳完的凝胶放入400mL的固定液中固定5min，然后用蒸馏水清洗一次；

银染：在400mL的银染液中银染12min,然后用蒸馏水清洗一次；

清底：在400mL的硫代硫酸钠溶液里面洗30s，变黄倒掉，用蒸馏水清洗一次；

显影：然后将凝胶放入400mL的显影液中6～10min，待显出条带后再用蒸馏水清洗一次；

终止：用400mL的终止液终止显影，在胶片灯下观察拍照；

分析：在五节芒与荻杂交种植株中包含一个大小100bp左右的特异性条带和一个大小为123bp左右的特异性条带；确定为真实杂交种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述的五节芒与荻杂交种是利用湖南邵阳五节芒和陕西凤县的荻为亲本培育出的杂交群体。