[发明专利]PCR-SSP法定性检测HLA-B*1502基因的方法及临床试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种定性检测HLA-B*1502基因的方法及相应的临床检测试剂盒。 

背景技术

癫痫病是一种高发性神经性疾病，发病人数在国外每年为40～70/10万人口，国内为30/10万左右^[1]，治疗癫痫的主要药物有苯妥英钠、卡马西平、乙琥胺、丙戊酸钠等常规药物及拉莫三嗪、奥卡西平、托吡酯等新型药物。卡马西平和苯妥英钠是目前常用的一线抗癫痫药，对复杂部分性发作的癫痫具有显著的疗效。抗癫痫药物的副反应有头痛头晕、行走不稳、厌食、恶心、呕吐，长期服用对人体的记忆、运动速度、神经系统有很大危害，会导致精神失常、人体各器官机能损伤，儿童智力发育受影响及可能威胁生命的皮肤不良反应，皮肤不良反应包括轻度的斑丘包疹及重度的重型药疹Stevens-Johnson综合征（SJS）和中毒性表皮坏死松解症（TEN）。SJS和TEN是罕见的皮肤疾病，其发病率分别为每年每百万人1.2～6和0．4～1.2人次^[2]，SJS的死亡率是5%，TEN的死亡率达25-35%。多种抗癫痫药物都会诱导SJS-TEN，包括芳香环药物卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥及非芳香环的拉莫三嗪，发病率为1-10/10000左右。对亚洲人群（中国东南部^[3]，马来西亚^[4]，泰国^[5 ]）研究证实卡马西平、苯妥英钠诱导的SJS-TEN与患者是否携带HLA-B*1502基因有很大关联。美国食品药物管理局（FDA）给出了相关警告且将HLA-B*1502列为卡马西平和苯妥英钠诱导SJS-TEN的基因关联生物标记物。美国食品药物管理局（FDA）的资料显示，中国、泰国、马来西亚和台湾等亚洲地区带有HLA-B*1502的人群高达10%以上，而日本、韩国带有HLA-B*1502的人群的比率低于1%，欧洲人群的HLA-B*1502则很罕见^[6]。因此对癫痫病人首先进行HLA-B*1502分型再决定是否给病人服用卡马西平、苯妥英钠还是其他替代药物是很有意义的。 

人的主要组织相容性复合体（MHC）称为HLA（human leukocyte antigen）。HLA复合体位于第6号染色体短臂上6p21.3（6号染色体短臂2区1带3亚带），全长约4000kb。HLA-B*1502是其中的一个等位基因，代表一种单体型。HLA-B基因序列比较复杂，每个基因型与其他相比有数个不同且不相连的位点差异，因此一般的PCR难以进行分型。目前检测HLA-B*1502的主要方法为PCR-SBT（Polymerase chain reaction sequence-based typing，基于测序分型的聚合酶链反应）^[7]、PCR-SSP（Polymerase chain reaction sequence specific primer，序列特异引物引导的聚合酶链反应）^[8]和PCR –SSO（PCR using sequence-specific oligonucleotides，序列特异性寡核苷酸探针杂交聚合酶链反应）^[9]三种方法检测。PCR-SBT方法是对HLA基因的B位点进行测序，进而确定HLA-B*1502的高分辨率方法，但是其需要很高的人力及物力花费，需要精密的高端仪器在专门的研究中心实验，并且周转时间较长（大于1天）；PCR-SSP方法是利用与HLA等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异特异性PCR扩增，具有人力、物力花费低，时间短的特性；PCR-SSO 方法是PCR扩增产物用一组与HLA等位基因序列互补探针进行杂交，然后确定HLA-B基因型的方法，其缺点是设备要求高、操作过程复杂，难以在短时间内完成全部HLA等位基因的分型。总的来说PCR-SSP相对是比较简单方便、特异性高的方法。传统的PCR-SSP方法需要四对特异引物和两对内参引物进行6次PCR反应，这不仅造成检测繁琐，分析困难，而且无论是灵敏度还是特异度均不够理想。如果想把PCR-SSP方法推广到临床应用当中，其价格、反应时间还可以再进行优化。目前市场已有的基于PCR-SSP方法单特异引物检测HLA-B*1502试剂盒是台湾的Pharmigene公司的PG1502试剂盒^[10]，其特异度为98.35%（616个样本），由于价格较高，不便在内地市场推广。另外，其检测引物不能区别 HLA-B*15:13， 15:31， 15:55， 15:88， 15:89， 18:20， 95:12， 95:21， 95:44， 95:70等HLA-B等位基因，会产生假阳性。且该试剂盒没有采取防PCR污染的措施，在临床检测中也容易导致假阳性。假阳性结果使得病人无法选择合适的药物，其后果对于儿童癫痫患者特别严重。相比其他药物卡马西平对儿童的副作用较小，丙戊酸钠会对肝脏产生重大损伤，而苯巴比妥会造成儿童智力下降。若检测有假阳性存在会导致儿童无法正确选用卡马西平而服用其他药物，造成可能的损害。