[发明专利]鉴别马立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，特别是涉及用于鉴别马立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物及试剂盒。

背景技术

马立克氏病(Marek’s disease，MD)又名神经淋巴瘤病(neurolymphomatosis)，是由马立克氏病病毒引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性肿瘤疾病，以对鸡的外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单个或多个组织器官发生单核细胞浸润为特征，导致上述各器官和组织形成肿瘤。病鸡常见消瘦、肢体麻痹，并常有急性死亡。在病原学上可以与鸡的其他淋巴样肿瘤病相区别。

目前在我国，马立克氏病血清1型疫苗毒包括814株和CVI988株。814与CVI988在免疫效力上不分上下，但国内在临床上使用814和CVI988时，无法对免疫鸡群进行二者使用情况有效区分，从而容易产生混淆和纠纷。因此，建立一种能快速区别814与CVI988疫苗、甚至区分814与其他MDV血清1型野生强毒的简单快速方法，对我国自主研发的MDV病疫苗814的使用和推广至关重要。同时，无论是814还是CVI988的使用，在临床上，一直给MD的确切诊断带来了很大的困难，因此，研究区分MDV疫苗毒和野毒的鉴别诊断一直受到极大的关注。例如有报道针对CVI988的基因组PP38的上游启动子序列有连续5个核苷酸缺失，而其他毒株包括814没有发现这样的缺失，故针对此缺失，设计合成两对引物，一对引物只能扩增CVI988，另外一对引物能扩增包括814在内的其他MD血清一型病毒，在一次PCR后，可以把CVI988与其它病毒区分出来，但无法区分是疫苗毒814株还是野毒。因此，在生产及科研上，还不能把使用过814疫苗的鸡群进行MDV野毒感染的确定性诊断。通过实时定量PCR方法检测鸡外周血淋巴细胞马立克病毒基因组DNA载量证实，强弱毒株的复制动力学存在一定的差别，可作为MD早期诊断的标准，但是这种方法比较难运用到实际生产中去。进一步区分还需要对PCR产物进行测序。

2010年，韦平等开发了“一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法”，该方法的工作原理：设计一对独特的引物，能对所有MD血清1型病毒进行有效扩增，不同的病毒扩增出不同大小的片断：CVI988和814疫苗，扩增出730左右的条带，而其他野毒MDV扩增出930以上的大条带。因此，韦平的方法能把基因组很相近的疫苗毒和野强毒进行一次PCR区分，解决了目前未能快速区分MDV疫苗毒和强毒的难题。但该方法仍然不能区分血清1型疫苗毒中的CVI988和814株。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鉴别马立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物。

本发明的另一目的在于提供用于鉴别马立克氏病病毒血清1型疫苗毒的试剂盒。

为实现上述目的，通过对目前已经公开的MDV全序列进行详细比较和分析（本发明的参考序列在NCBI中登陆号分别为：CVI988-DQ530348，GA-AF147806，LMS-JQ314003，MD5-AF243438，MD11-AY510475，RB-1B-EF523390，MD814-JF742597，JF742597）设计出能够鉴别马立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物。

本发明提供的用于鉴别马立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物，包括SEQ ID NO.1~2所示的核苷酸序列。

本发明提供了SEQ ID NO.1~2所示的引物在鉴别马立克氏病病毒血清1型疫苗毒中的应用。

本发明提供了一种鉴别马立克氏病血清1型疫苗毒株的诊断试剂，包括SEQ ID NO.1~2所示的引物。

本发明还提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示的引物的试剂盒。

本发明的试剂盒，是采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示的引物进行PCR扩增，有目的条带扩增的样品为马立克氏病病毒血清1型疫苗毒阳性，否则为阴性。

进一步地，采用上述引物进行PCR扩增后，只具有长度为250bp的扩增产物条带的样品为马立克氏病病毒血清1型疫苗毒CVI988株，具有长度为250bp和750bp两条特异产物条带的样品为马立克氏病病毒血清1型疫苗毒814株。

进一步地，上述PCR反应条件为：95℃3min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃1min，循环40次；72℃10min。

更进一步地，本发明还提供了含有核苷酸序列如SEQ IDNO.1~2和SEQ ID NO.3~4所示的2对引物的试剂盒。

上述含有2对引物的试剂盒，其工作程序为：