[发明专利]一种重组猪白细胞介素4及其编码基因和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪白细胞介素4及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法。

背景技术

白细胞介素4(Interleukin4，IL-4)由活化的T细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞合成分泌，是一种多功能淋巴因子，具有多种复杂的生物学活性，包括调节T淋巴细胞的生长、繁殖和分化;调节受抗原刺激的T细胞分化过程，使分化后的T细胞能够产生IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等细胞因子。IL-4比较重要的生理功能还包括能够控制免疫球蛋白类型转换的特异性，受到IL-4刺激的人B细胞开始转为表达IgE和IgG4。IL-4对T细胞、B细胞和NK细胞的诱导反应在清除蠕虫感染，治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面发挥着重要的免疫调节作用，由此可见，IL-4可用作免疫佐剂、治疗剂以及疾病感染的诊断指标，在疾病预防控制和诊断等方面具有重要的意义。目前，对IL-4在小鼠、兔、羊、牛和人的生物学活性功能研究的报道有很多，但是对猪IL-4的研究相对较少，并且对其特异的检测系统和生物学活性评价系统的研究也不多见。

我国是世界养猪大国，为应对当前养猪业重大疫病时有发生和流行病愈加复杂的情形，我们必须运用新的科学理论和生产技术来发展养猪行业，采用高效疫苗预防和控制各种疫病的发生和流行。猪白细胞介素4是猪疫苗研究的重要组成部分，然而天然的猪白细胞介素4在机体内表达甚微，很难直接从体内大量提取供临床研究及应用。目前，通过基因工程技术可大量生产重组猪白细胞介素4，从而满足研究和应用的需求。原核表达系统是最早被采用进行研究的，也是目前掌握最为成熟的表达系统。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但是，原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：例如无法对表达时间及表达水平进行调控、外源蛋白的表达对宿主细胞毒性作用、产物纯化困难等；除此之外，由于原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，产物多以生物活性较低包涵体的形式产生。而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复兴的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白的自身性质。如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又易产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是：使大肠杆菌表达的猪IL-4蛋白包涵体复性为具有生物活性的细胞因子。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达的重组猪白细胞介素4及其编码基因和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了一种重组猪白细胞介素4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了编码上述所述重组猪白细胞介素4的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪白细胞介素4的基因的载体，所述的载体优选为原核表达质粒，最优选为pET21b。

本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21（DE3）菌株。

本发明还提供了重组猪白细胞介素4在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：

该方法的步骤为：

1.挑取一个含有上述所述重组猪白细胞介素4的大肠杆菌菌落，接入含氨苄青霉素的50mL的LB培养液，在250mL摇瓶中于37℃培养过夜；

2.取5mL过夜培养物接入于500mL的含氨苄青霉素的LB培养液中，在2L摇瓶中于37℃震荡培养至对数中期（A₆₀₀=1.0）；

3.在培养物中加入IPTG至1mmol/L，于37℃，诱导表达4h后，于4℃以5000rpm/min，离心处理15min收集含有重组猪白细胞介素4的大肠杆菌菌体沉淀。

所述LB培养液中氨苄青霉素的含量为50-100μg/mL。

本发明还提供了重组猪白细胞介素4的包涵体纯化方法，包括如下步骤：

1.将收集得到的上述含有诱导重组猪白细胞介素4大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4℃高速离心处理；重复一次。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液BufferA3-10mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。