[发明专利]一种重组猪白细胞介素4及其编码基因和表达方法

权利要求书

1.一种重组猪白细胞介素4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种编码权利要求1中所述的重组猪白细胞介素4的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种载体，所述载体具有权利要求2的基因。

4.如权利要求3所述的载体，所述载体为pET21b。

5.一种大肠杆菌，所述大肠杆菌具有权利要求3的载体。

6.如权利要求5所述的大肠杆菌，所述大肠杆菌为BL21（DE3）菌株。

7.一种重组猪白细胞介素4在大肠杆菌中的表达方法，包括如下步骤：

（1）在合适的条件下于培养基中培育权利要求5或6中所述的大肠杆菌；

（2）从大肠杆菌和/或培养基中分离重组猪白细胞介素4。

8.如权利要求7所述的表达方法，包括如下步骤：

（1）挑取一个含有权利要求5或6中所述的大肠杆菌菌落，接入含抗生素的LB培养液，培养过夜；

（2）取过夜培养物转接入于含抗生素的新鲜LB培养液中，震荡培养至对数中期A₆₀₀=1.0；

（3）在培养物中加入浓度为1m mol/L的IPTG，37℃，诱导表达4小时后，离心处理收集含有重组猪白细胞介素4的大肠杆菌菌体沉淀。

9.一种重组猪白细胞介素4的纯化和复性方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）将权利要求8中所述的含有重组猪白细胞介素4的大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃，以12000rpm/min离心15min，重复一次；

（2）吸去上清，按每克（菌体湿重）加入3-10mL裂解缓冲液BufferA，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起；

（3）每克（菌体湿重）菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，冰上搅动20min；

（4）破碎菌体细胞，4℃，12000rpm/min离心，弃上清。

（5）包涵体沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃，12000rpm/min离心15min，弃上清。包涵体沉淀重复本步骤一次；

（6）包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温搅拌30-60min；

（7）充分混匀后室温条件下12000rpm/min离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素4变性溶液；

（8）用变性缓冲液Buffer C将重组猪白细胞介素4变性溶液的浓度稀释至0.2mg/mL，4℃透析复性24小时，期间每隔6小时更换一次缓冲液Buffer D，重组猪白细胞介素4复性溶液经滤膜过滤后，即得到重组猪白细胞介素4复性溶液。

10.如权利要求9所述的纯化和复性方法，其特征在于，所述重组猪白细胞介素4复性溶液可进一步用截留分子量10KDa的超滤浓缩、脱盐至小体积，低温真空干燥，即获得重组猪白细胞介素4粉末。