[发明专利]一种筛选抗细菌粘附抑制剂的方法和抗粘附口服液的制备

说明书

技术领域

    本发明涉及一种筛选抗细菌粘附抑制剂的新方法和一种抗细菌粘附口服液的制备。

背景技术

抗生素为治疗和预防细菌感染做出了重大贡献，但是由于抗生素的广泛使用（包括滥用），细菌耐药性问题已经成为严重威胁人类健康的重大问题。现有抗菌药物的特征是破坏细菌的生命功能，如干扰细菌细胞壁的合成、破坏细菌DNA的复制或蛋白质的合成等，正是这些作用机制的选择压力，促进了耐药菌株的出现。为解决细菌的耐药性问题，一种新的抗菌药物研发思路逐渐形成，即研究以抑制细菌毒力因子或阻断细菌与宿主细胞的联系为作用机制的新型抗菌药物。

细菌都能表达粘附素（adhesin），环境中的大部分细菌都能粘附到一定界面而形成固定群落。粘附素有两类，即菌毛（pili，fimbriae）和非菌毛粘附物质（afimbrial adhesin）。病原菌粘附到宿主细胞表面是细菌感染的关键步骤，比如呼吸道、泌尿道、消化道的细菌感染都涉及粘附问题。此外，在细菌形成生物膜（biofilm）的初期，细菌粘附起重要作用。细菌生物膜能保护细菌逃避机体的免疫应答、屏蔽抗菌药物、削弱机体内部流体剪切力对细菌的作用，并引起二次感染。因此，细菌粘附抑制剂的研究近年来受到广泛关注。

目前筛选细菌粘附抑制剂的方法主要采用结晶紫染色比色法，具体方法如下：将细菌接种在含液体培养基的96孔板中，试验样本加入液体培养基中，不加样本的做阴性对照，培养一定时间后，漂洗培养板，去除悬浮细菌，自然干燥，往板孔内加入结晶紫溶液，再洗去结晶紫溶液，然后加入一定量甲醇溶液，在540nm测定吸光值，吸光值越大表明粘附在孔表面的细菌越多，抗细菌粘附抑制剂能防止细菌粘附，因此，被筛选样本如果有抑制细菌粘附的作用，则吸光值小。这种方法的优点是能一次完成多个样本的筛选，缺点是可能出现假阴性结果，因为一些样本自身可被孔表面吸附，并能被结晶紫着色，显示的吸光值并不是因细菌粘附形成的。发现更客观的方法对筛选抗细菌粘附抑制剂具有重大意义。

尽管对细菌的粘附现象及其危害已经取的较大进展，但是迄今为止，没有一种抗细菌粘附抑制剂进入临床，目前，对细菌引起的消化道、呼吸道、泌尿道感染的治疗依然依赖大剂量给予抗生素的策略，加剧了耐药菌的出现和二次感染的发生。所以发现具有抗细菌粘附的制剂具有重要的社会价值和经济利益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：制备抗细菌粘附的口服液。

本发明的另外一个目的是：克服传统方法在筛选抗细菌粘附抑制剂时可能导致假阴性的缺点，本发明提供了一种能直观判断被筛选样本是否具有抗细菌粘附的方法。

本发明的技术方案：

一种抗细菌粘附口服液，配方包含：冷水花40克、金银花60克和茯苓100克，并制成口服液。

一种抗细菌粘附口服液的制备方法，冷水花、金银花混合，水煎煮3次，合并煮液，浓缩后干燥，得到混合水提取A；茯苓用水煎煮，煮液冷却后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到浅黄色干粉B；取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入100ml自来水中，加热溶解后灭菌，冷却后加入1ml的红茶菌菌液，置30℃培养箱静置培养7-9天，待pH值降到4时，停止发酵，过滤得到发酵液，发酵液冷冻处理48小时，解冻后高速离心除菌，上清液无菌罐装，置4℃冰箱保存。

一种筛选抗细菌粘附抑制剂的方法，将灭菌的普通肉汤加入无菌培养皿中，放入一张五边形的无菌载玻片，载玻片的一端浸入肉汤中，另一端架在培养皿边缘上，先加入灭菌上述上清液，再加入细菌悬液，阴性对照不加样本溶液；将培养皿置37℃培养箱培养24小时，然后，取出载玻片，在无菌水中漂洗，将接触肉汤一面火焰固定，结晶紫染色，置显微镜下观察，导出图像。

  本发明达到的有益效果

本发明制备的抗细菌粘附口服液能抑制大肠杆菌的粘附，最小有效浓度为1%（V/V）。小鼠实验表明，本发明的抗细菌粘附口服液能终止肠炎沙门氏菌、大肠杆菌的人工感染，能有效治疗兔尿道大肠杆菌的人工感染。志愿者试验表明，本发明的抗细菌粘附口服液具有抗肠道感染、尿道感染的作用，还具有治疗感冒的药效。

水提取A和干粉B在水中加热溶解后，口感不佳，用红茶菌发酵后，口味以酸为主，口感得到提高。

本发明能直观显示细菌粘附的图像，直观判断被筛选样本是否抗细菌粘附。

本发明的抗细菌粘附口服液志愿者口服治疗效果