[发明专利]一种臂尾轮属轮虫的线粒体ND5基因的部分DNA测序及鉴定臂尾轮属轮虫的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种臂尾轮属轮虫的线粒体ND5 基因的部分DNA测序及鉴定臂尾轮属轮虫的方法。 

背景技术

早期的轮虫分类学和系统学研究主要是依据形态学数据。如Wallace（1989）利用八种形态学特征进行聚类分析研究发现轮虫门（Rotifera）、真轮虫总纲（Eutatoria）和单巢纲（Monogonota）为单系，利用九种形态学特征进行聚类分析研究发现叶轮属（Notholca）分为六个分支。Melone（1998）通过对1种棘头动物、6种轮虫和2个外群（涡虫和颚胃动物）的60个形态特征进行矩阵分析，获得一个简约聚类树，发现双巢纲（Digononta）为并系类群，但不能确定轮虫门的单系性。该系统树不同于依据分子水平数据或演化分类原理而产生的系统树。以形态学数据所研究的轮虫系统学存在缺陷，因为轮虫的形态受遗传和环境因子两方面的影响，尽管遗传因素占主导地位。随着轮虫研究的深入，已有研究者发现形态学数据已经不能满足轮虫部分种类鉴别和系统进化研究（Guiset，1977；Koste，1978；Shiel，1993；Fontaneto，2007）。Sergi(2005)等研究了褶皱臂尾轮虫(B. plicatilis)L-型的两个种B. plicatilis sensu stricto 和B. manjavacas之间的形态度量差异，发现B. plicatilis s.s.比B. manjavacas平均长6％，两个种的个体之间表现出较大的形态度量交迭，形态学分类不能用于鉴别这两个种，目前它们的分类只能依据分子指标。2003年，为了了解形态可塑性和基因变异在轮虫的形态变化中的作用，Derry等研究了不同形态的龟甲轮虫(Keratella)线粒体COⅠ基因序列，发现有棘刺和无棘刺的螺形龟甲轮虫(Keratella cochlearis)遗传变异较大，核酸序列的差异达到4.4％，暗示它们是不同的种。而单棘刺和双棘刺的曲腿龟甲轮虫(K. hiemalis)核酸序列的差异为0.21％，并且氨基酸序列没有变异，说明它们的形态变异归因于环境的诱导。 

传统的轮虫分类主要依据头冠、棘刺、足和口器等外部形态和内部结构等形态学特征。但由于轮虫种类众多、体型微小及表型可塑性，轮虫外部形态有些物种非常相似，并且同一物种还有季节性的周期变形，且许多种类缺乏有效地形态学分类特征，仅通过传统的方法进行鉴定和分类存在一定的困难，如壶状臂尾轮虫和红臂尾轮虫均为臂尾轮属常见种类，因它们具有相似的形态，早期的研究曾将这两种轮虫归为一种，称为Brachionus urceus，也译为壶状臂尾轮虫（张家楫）；后来Koste、章宗涉和黄祥飞等根据虫体前端棘刺的两侧是否对称 和眼点的形状把B.urceus分为B.urceolaris和B.rubens两种，因此种的界定标准仍存在模糊不清之处，因此传统鉴定方法满足不了鉴定要求，并且内部咀嚼器的超微结构需要电子显微镜的辅助，鉴定困难。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种臂尾轮属轮虫的线粒体ND5 基因的部分DNA测序及鉴定臂尾轮属轮虫的方法，本鉴定方法使用实验所设计的引物扩增轮虫线粒体上ND5 DNA序列，并对PCR产物进行纯化、连接、克隆、转化、测序，将序列进行比对分析来鉴别轮虫的种类。对轮虫进行分子生物学的种类鉴定，解决了利用形态学和超微结构存在的鉴定困难，使得在大规模培养轮虫的过程中，减少种群混杂带来的种群竞争而造成轮虫减产甚至大量死亡的可能性。 

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是： 

一种臂尾轮属轮虫的线粒体ND5基因的部分DNA测序方法，包括以下步骤： 

A、臂尾轮属轮虫总DNA提取； 

B、PCR引物扩增及序列测定； 

C、系统发生分析。 

 所述步骤B中PCR引物为：ND5W1: 5' -TTTC(AT)GCTTT(GA)GTTCATTCTTC-3'和CO3B: 5' -GTCTACCTCA(AG)TAAAT-3'； 

扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s, 48℃退火50s, 68℃延伸3min, 共15个循环；95℃预变性5min；95℃变性30s, 48℃退火50s, 68℃延伸3min, 延伸时间每个循环加5s，共15个循环；最后72℃延伸10min, 4℃保存。 

一种鉴定臂尾轮属轮虫的方法，使用臂尾轮属轮虫的线粒体ND5基因的部分DNA序列进行鉴定进行鉴定。