[发明专利]乌贼精氨酸激酶基因及其原核表达载体和工程菌

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及到一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶——精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)及其原核表达载体。

背景技术

精氨酸激酶属于磷酸原激酶家族中的重要一员，广泛的存在于无脊椎动物如昆虫、虾、蟹及软体动物中，起着类似于脊椎动物中肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)的作用，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。磷酸原激酶家族可逆催化肌酸或精氨酸与ATP之间的转磷酰基反应，形成高磷酸化的肌酸或磷酸精氨酸。高能磷酸原在能量储备方面起关键作用，因为当需要ATP再生时，可以在磷酸原激酶的催化下由磷酸原转化而来。磷酸原不仅是一个能量储备库，而且在不断耗能的体系中它是一个能量传送体。近年来，磷酸原激酶的抑制作用研究越来越受到关注，不同来源的磷酸原激酶家族成员因其在能量代谢中的重要地位而成为研究酶抑制作用的靶目标。例如，针对有害昆虫体内AK进行有效抑制剂的筛选，可以为开发环境友好的杀虫剂提供新的方向。

虽然磷酸原激酶家族(包括CK和AK)在功能上有很多相似之处，但CK和AK在催化机制上有很大的差异。肌酸激酶是脊椎动物中唯一的磷酸原激酶，而精氨酸激酶是节肢动物和软体动物中的唯一磷酸原激酶。CK通常存在于动物的骨骼肌、心肌以及脑部等组织的细胞浆和线粒体中。它不仅在脊椎动物能量代谢中起了重要作用，而且还参与了脊椎动物生命过程中的其他的一些生理活动：肌浆内质网和细胞表面的离子跨膜运输，巨噬细胞的吞噬作用，糖酵解的调控，脑神经突触中依赖ATP的神经递质的释放，非肌肉细胞中有丝分裂的供能等。除此之外，CK在临床诊断上也具有十分重要的意义。Wyss等已发现CK系统的调控紊乱与一系列的疾病相关，在肌肉、脑、心脏和肾脏相关疾病以及癌症的发生过程中均发现了CK系统的紊乱。当肌肉萎缩和心肌梗塞等病变发生时，人血清中CK水平迅速升高，目前认为CK的活性测定在心肌梗塞的诊断中比做心电图更为可靠。CK重要的生理功能和临床应用价值引起了人们的广泛重视和深入研究。

相对于CK，目前对AK的研究还比较少。作为磷酸家族中的重要一员，AK在无脊椎动物的细胞能量代谢中起重要的作用，其广泛分布于各种需能组织中。因此对该基因的克隆与原核表达，可以直接应用于研究该酶的结构及功能，并为其在其它方面的应用奠定基础。

发明内容

本发明的任务是提供一种乌贼精氨酸激酶基因及其原核表达载体和工程菌。

实现本发明任务的方案是：

本发明提供的乌贼精氨酸激酶基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，该精氨酸激酶基因编码的精氨酸激酶蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了含有上述精氨酸激酶基因的原核表达载体，所述的原核表达载体是含有组氨酸标签(His标签)的原核表达载体pET30a，精氨酸激酶基因位于pET30a之T7启动子的下游。

本发明还提供了表达上述精氨酸激酶的工程菌，它是将以上所述的重组表达载体导入到宿主菌后得到的重组菌，所述的宿主菌可以是肠杆菌BL21菌株。

本发明提供的精氨酸激酶(AK)基因来源于曼氏无针乌贼(sepiella maindroni)。本发明提供了表达乌贼AK基因的原核表达载体pET30a-AK，该载体含有AK基因，AK基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，AK基因的N端和C端均带有6×His标签。

本发明实验资料：

AK全长基因的克隆

(1)AK基因3’端和5’端序列的获得

对Genbank中的一段乌贼EST序列(GT618444.1)进行生物信息学分析，结果表明该序列与其他无脊椎动物的精氨酸激酶基因同源性较高，属于磷酸原激酶家族成员，因此命名为AK。根据该序列设计扩增所需的特异引物。其中

AK-F1：5′-GCGGTGTTGGTATCTATGCTTG-3′和

AK-F2：5′-ATGGCTTCCCTCCAGTCCTCAC-3′用来扩增AK基因的3′端；

AK-R1：5′-GTCTTGTCCTGGTTGAAGTAAAT-3′和