[发明专利]一种耐贮猕猴桃新品种的选育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物新品种的选育方法，具体指耐贮猕猴桃品种的选育新方法。

背景技术

猕猴桃是典型的呼吸跃变型果实，研究发现：乙烯对于猕猴桃等呼吸跃变型果实的成熟具有举足轻重的作用，通过控制猕猴桃果实内乙烯的生成可有效延长猕猴桃贮存的时间。

在乙烯生物合成的过程中，有三个酶起着相当重要的作用，分别为：腺苷蛋氨酸合成酶（SAM synthetase,SAMS)、ACC合成酶（ACC synthase,ACS)、ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)，其中ACO在乙烯生物合成过程中特别关键，通过调控ACO基因及其表达，就可以很好的控制果实内源乙烯的合成，从而达到延长果实贮藏时间的目的。

大多数采用转基因方法获得的耐贮猕猴桃新品种均带有筛选标记，随着转基因植物研究的深入和转基因作物的大规模产业化，转基因植物的安全性越来越受到人们的重视，带有筛选标记的转基因植物品种由于潜在的各种安全性问题，特别是由于抗生素筛选标记引发的转基因食品安全性问题，目前无法通过国家农业部的审查。

因此，开发获得无筛选标记的耐贮猕猴桃转基因植株，对于耐贮猕猴桃新品种的选育和转基因植物安全都具有重要意义。

发明内容

为解决耐贮猕猴桃新品种选育现有技术存在的问题，本发明人通过大量试验，终于发明出一种耐贮猕猴桃的选育新方法，运用该方法，能确保得到的猕猴桃新品种不仅耐贮藏，而且不带筛选标记，安全性高。

本发明包括以下几个步骤：

（1）ACO基因的获得。从猕猴桃叶片中提取RNA，再将RNA反转录成cDNA，最后通过设计引物获得ACO基因。

（2）将ACO基因反向连接入双右边界双元载体，将载体转化入农杆菌中，通过叶盘转化法导入愈伤组织中，再通过筛选培养基获得抗性愈伤组织，经过分化培养基培养获得含有筛选标记再生苗。双右边界双元载体是指载体有一条左边界和两条右边界，其中标记基因在左边界和第一条右边界链接，目的基因是在第一条右边界和第二条右边界之间。

（3）上游引物为Term F: 5′-GGT,GCT,TTC,CCA,GTC,CAA,ATC,GTT-3′，下游引物为Term R: 5′-CCA,GGT,TTA,GTC,GTC,TCG,TGT,CTG,GT-3′，进行PCR扩增，80－105℃预变性3－10min后运行下循环，94℃ 35 s，59℃ 35 s，72℃ 40 s，共35个循环，最后72℃ 10 min，25℃ 30 s，取PCR产物5－30 μL进行0.6%－1.5％琼脂糖凝胶电泳分离获得阳性植株（含有目的基因的植株，575bp）。

（4）通过遗传分离获得无筛选标记的含有目的基因的植株，将同时含有hpt基因和aco基因的共转化植株转移至温室栽培，随机挑选其中10－50个T0代植株进行自交产生T1代后对T1代植株的基因组DNA进行PCR检测，从而获得无筛选标记的含有目的基因的植株，含有目的基因的植株即为新的耐贮猕猴桃品种。

本发明的特点是将选择标记基因和目的功能基因分别构建到一个双元表达载体的两段不同T_DNA上，经农杆菌介导的遗传转化将目的基因和选择标记基因整合到同一染色体的不同部位，通过后代的筛选，获得无选择标记的转基因植株。该方法获得的耐贮猕猴桃品种安全性高，易于通过国家农业部审查。

具体实施方式

 以下通过实例对耐贮猕猴桃选育的具体方法进行详细说明。

实施例1

（1）ACO基因的获得，从猕猴桃叶片中提取RNA，再将RNA反转录成cDNA，最后通过设计引物获得ACO基因。

（2）将ACO基因反向连接入双右边界双元载体，将载体转化入农杆菌中，通过叶盘转化法导入愈伤组织中，再通过筛选培养基获得抗性愈伤组织，经过分化培养基培养获得含有筛选标记再生苗。

（3）上游引物为Term F: 5′-GGT,GCT,TTC,CCA,GTC,CAA,ATC,GTT-3′，下游引物为Term R: 5′-CCA,GGT,TTA,GTC,GTC,TCG,TGT,CTG,GT-3′，进行PCR扩增，95℃预变性5min后运行下循环，94℃ 35 s，59℃ 35 s，72℃ 40 s，共35个循环，最后72℃ 10 min，25℃ 30 s，取PCR产物10 μL进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分离获得阳性植株。