[发明专利]表达嗜热子囊菌光孢变种lgh基因的毕赤酵母工程菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达嗜热子囊菌光孢变种Thermoascu aurantiacus var.levisporus热稳定脂肪酶基因lgh的毕赤酵母工程菌株Pichiapastoris GS-TA-LGH。

（二）背景技术

脂肪酶（lipase）全称三酰甘油酰基水解酶，属于α/β折叠酶家族。它能够分解生物产生的各种天然油和脂肪，在生物体内参与胞内脂的代谢等重要生命活动。脂肪酶的应用涉及洗涤剂、食品、油脂、皮革、医药等工业，近些年来又被研究用于制备化学方法难以得到的手性化合物，以及用于生产作为绿色可再生能源的生物柴油，使得它再度成为生物及化工工业的研究热点。因为微生物脂肪酶种类多、周期短，耐受性好且易于工业生产，所以在酶理论研究和工业应用中有着更重要的作用。

嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var.blevisporus）在以橄榄油为诱导源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的脂肪酶，但要使之用于规模化工业生产，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热子囊菌光孢变种培养条件比较苛刻，高温发酵需要特殊设备，产酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将嗜热子囊菌光孢变种热稳定脂肪酶基因导入常温酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使热稳定脂肪酶基因在常温和短时间内快速、大量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。

（三）发明内容

本发明以嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）为材料获得一种脂肪酶基因，命名为lgh，全长cDNA为1009bp，包含一个由894个核苷酸构成的开放阅读框，编码297个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现该脂肪酶属于脂肪酶第3家族。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/lgh，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-TA-LGH。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d后，脂肪酶活达到19.92U/mg，SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为58kDa，酶在50℃保温60min，不损失活性，在60℃保温60min，仍有66％的活性。具有较高的热稳定性，有重要的经济价值和社会价值。

（四）附图说明

图1脂肪酶基因lghPCR产物电泳图谱

泳道M：Marker-DL2000

泳道2：cDNA(ORF)

图2脂肪酶LGH的SDS-PAGE分析

泳道M:低分子量蛋白Marker

泳道1-7：酵母工程菌Pichiapastoris GS-TA-LGH的诱导1-7天的表达情况

图3重组脂肪酶LGH的纯化

泳道M：低分子量蛋白标准

泳道1：纯化的重组脂肪酶LGH

（五）具体实施方式

实施例1：嗜热子囊菌光孢变种（T.aurantiacus var.levisporus）的分离鉴定

（1）标本采集：从堆肥中采集。

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：脂肪酶基因lgh的克隆

（1）嗜热子囊菌光孢变种总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。