[发明专利]一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法

说明书

技术领域

本发明属于鲫鱼消化吸收率分析技术领域，涉及一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法。

背景技术

鱼类对饲料中营养物质的充分利用是鱼类快速生长的必要条件，因此其对营养物质的消化吸收直接影响鱼类生产性能的提高。在饲料配方中，把鲫鱼对饲料的消化吸收率进行准确评价以选择优良饲料是确保鲫鱼高效养殖的重要前提。

消化吸收率是评价饲料营养价值的重要指标之一。而目前对其研究的方法主要有两种：体外消化法和体内消化法。体外消化法虽简便但无法反映体内消化的真实情况，所以缺乏可靠性，已很少采用。体内试验法又分为直接法和间接法两种。直接法由于工作量太大而没有间接法那样应用广泛。无论是直接法还是间接法，都存在粪便的收集问题，操作繁琐。

相关研究发现，CDX2作为一种肠道上皮细胞特异性核转录因子，对肠道发育以及营养物质在肠道内消化吸收起着关键性作用。它调控了机体内糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢和矿物元素代谢等相关功能基因的表达，并对肠道上皮细胞增殖、分化具有重要的调节作用。在实践中发现，CDX2基因的相对表达量随着鲫鱼消化吸收率的升高而升高，降低而降低。于是就产生了用CDX2基因作为鲫鱼消化吸收率的一个分子标志，进而用来评价鲫鱼对某种饲料消化吸收的程度，具有重要的理论指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，该方法能够对鲫鱼的消化吸收率进行准确的评定并能预测其以后肠道消化吸收的潜力，为鲫鱼的饲料配方优化提供技术支持。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法包括以下步骤：

（1）取待检测的鲫鱼，解剖并分离出肠道，将肠道投入保存液中，以用于基因表达的分析；

（2）提取第（1）步中的肠道总RNA；

（3）反转录合成cDNA；

（4）以第（3）步中的cDNA为模板，用CDX2引物进行PCR克隆，其中，CDX2引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

（5）实时荧光定量PCR检测，其中，目的基因引物为所述的CDX2引物，荧光定量内参基因引物为管家基因β-Actin引物，该引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

（6）定量PCR结束后，从扩增曲线得出Ct值，计算CDX2基因的表达量，CDX2基因的表达量=2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)- ΔCt校准样，根据CDX2基因的表达量来判断鲫鱼消化吸收率的高低，即CDX2基因的表达量高，鲫鱼的消化吸收率高，相反，CDX2基因的表达量低，鲫鱼的消化吸收率低。

上述的基因分析方法，第（4）步cDNA片段克隆的PCR反应体系：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH₂O加至25 μL；PCR反应流程：94 ℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，4℃10 min。

上述的基因分析方法，第（5）步实时荧光定量PCR检测， 按照SYBR Green I 染料法要求，二步法进行定量PCR，反应体系：Takara SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL、浓度10 μM的上下游引物各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH₂O加至25 μL，反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s、55 ℃ 25 s、72 ℃ 11 s 共40个循环，95 ℃1 min、55 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s 终止，4 ℃保存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）本发明提供的用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，将传统的化学分析方法提高到分子水平的基因分析方法，操作简单且准确率高。

（2）以肠道上皮细胞特异性核转录因子CDX2基因的表达作为鲫鱼肠道消化吸收率的评定方法，根据其表达量的高低来进行鲫鱼消化吸收率的分析，不但可以从分子水平快速方便对鲫鱼消化吸收率进行评定，还可以对其以后肠道消化吸收的潜能进行评定，方法简单且准确率高，能够为鲫鱼饲料配方优化提供技术支持。

附图说明