[发明专利]一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法

权利要求书

1.一种用于检测鲫鱼肠道消化吸收率的基因分析方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取待检测的鲫鱼，解剖并分离出肠道，将肠道投入保存液中，以用于基因表达的分析；

（2）提取第（1）步中的肠道总RNA；

（3）反转录合成cDNA；

（4）以第（3）步中的cDNA为模板，用CDX2引物进行PCR克隆，其中，CDX2引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

（5）实时荧光定量PCR检测，其中，目的基因引物为所述的CDX2引物，荧光定量内参基因引物为管家基因β-Actin引物，该引物的上游核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

（6）定量PCR结束后，从扩增曲线得出Ct值，计算CDX2基因的表达量，CDX2基因的表达量=2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)- ΔCt校准样，根据CDX2基因的表达量来判断鲫鱼消化吸收率的高低，即CDX2基因的表达量高，鲫鱼的消化吸收率高，相反，CDX2基因的表达量低，鲫鱼的消化吸收率低。

2.根据权利要求1所述的基因分析方法，其特征在于：第（4）步cDNA片段克隆的PCR反应体系：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH₂O加至25 μL；PCR反应流程：94 ℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，4℃10 min。

3.根据权利要求1所述的基因分析方法，其特征在于：第（5）步实时荧光定量PCR检测， 按照SYBR Green I 染料法要求，二步法进行定量PCR，反应体系：Takara SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL、浓度10 μM的上下游引物各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH₂O加至25 μL，反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s、55 ℃ 25 s、72 ℃ 11 s 共40个循环，95 ℃1 min、55 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s 终止，4 ℃保存。