[发明专利]一种体外扩增γδT细胞的方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及γδT细胞培养方法，具体涉及一种体外扩增γδT细胞的方法。

[背景技术]

根据T细胞表面受体（TCR）的不同可将T淋巴细胞分为两种：αβT淋巴细胞和γδT淋巴细胞。在人体中，αβT淋巴细胞是参与免疫应答的主要细胞群，占成熟T细胞的90~95%，而γδΤ细胞仅占外周血T淋巴细胞的0.5%-5%，但γδΤ细胞是先于αβΤ细胞出现的，主要分布于皮肤，小肠、食道、肺和生殖器官等上皮组织内。γδT细胞属于机体的第一线防御细胞，在抗微生物感染免疫，尤其是在皮肤黏膜表面的免疫防御功能中，以及抗分枝杆菌感染中发挥重要作用。此外，研究还发现，γδT细胞具有无MHC限制性的杀瘤作用，对多种自体、同种异体或异种肿瘤细胞均表现出显著的杀伤活性，因此，γδT细胞作为一类重要的肿瘤过继免疫治疗的候选细胞正在引起越来越多国内外学者的关注。但是另一方面，由于γδT细胞在人体中所含比例较低，分离纯化到大量的γδT细胞较为困难，因而限制了其临床使用。因此γδT细胞体外高效扩增是解决这一问题的主要方法。

在这一领域，人们做了很多有益的尝试，国内在体外培养扩增γδΤ细胞通常采用IPP和IL-2共刺激法，但因费用相对昂贵且扩增倍数不足而未被广泛使用。

因此，为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的γδT细胞的方法，该方法操作简便，价格便宜，扩增γδΤ细胞效率高。

[发明内容]

本发明的目的是提供一种体外高效扩增γδT细胞的方法，提高γδT细胞的纯度和杀伤活性，使γδT细胞更适用于临床。

为实现上述目的，设计一种体外扩增γδT细胞的方法，该方法由以下步骤组成：

a.用抗TCRγδ抗体和CD28McAb预先包被T75培养瓶以备用，

b.将外周血单个核细胞转入包被的T75培养瓶中，加入含有唑来膦酸(Zoledronat)、HSP70、IL-7、IL-15和IL-2的无血清培养基，放入二氧化碳培养箱培养12~16天后获得大量较高纯度的γδT细胞。

上述方法还具有如下优化方案：

抗TCRγδ抗体浓度为1 μg/ml。

所述CD28McAb的在无血清培养基中的浓度为500ng/ml。

所述的唑来膦酸在无血清培养基中的浓度为1.00 μg/ml~3.87 μg/ml。

所述唑来膦酸在无血清培养基中的浓度为1.29 μg/ml。

所述HSP70在无血清培养基中的浓度为10 μg/ml~50 μg/ml。

所述HSP70在无血清培养基中的浓度为20 μg/ml。

所述IL-7在无血清培养基中的浓度为10ng/ml。

所述IL-15在无血清培养基中的浓度为50ng/ml。

所述IL-2在无血清培养基中的为1000IU/ml。

本发明提供了一种新的γδT细胞的体外培养方法，与常规培养方法相比，本方法的优越之处有以下几点：

（1）采用抗TCRγδ抗体和CD28McAb两种抗体包被，抗TCRγδ抗体提供了γδT细胞活化的第一信号，CD28McAb则为γδT细胞的活化提供了共刺激信号，使静息的γδT细胞得到充分的激活；

（2）TCRγδ具有庞大的序列多态性，目前已有两类分子被证实是TCRγδ配体：含磷酸基的非肽类小分子和热休克蛋白；用IPP刺激γδΤ细胞时所需浓度较高，加之IPP的价格昂贵，如果培养至临床所需要的细胞数量则培养成本较高，而唑来膦酸(Zoledronat)可以在较低的浓度下激活γδΤ细胞，所以选择使用合适浓度的Zoledrona来刺激γδΤ细胞，使其大规模培养成为可能；HSP70不仅能携带特异性肿瘤抗原，还可作为抗原呈递分子直接将抗原肽呈递给γδΤ细胞，使其活化增殖，发挥细胞毒和分泌细胞因子的双重功能；

（3）IL-2、IL-7和IL-15三种细胞因子组合的应用。IL-7是促进人类γδΤ前体细胞增殖和促进γδΤ分化成熟的重要因子；IL-15是一种多功能的细胞因子，促进T细胞的增值，此外IL-15可抑制活化的T细胞和B细胞由于抗Fas抗体、细胞因子耗竭、地塞米松等因素所致的凋亡；IL-2是T细胞的生长因子；三种细胞因子的组合使用既降低了单种因子的用量，使培养成本无明显提高，又保证了发挥作用的全面性，大幅提高了γδT细胞的增值倍数和毒性。

[附图说明]

图1是两组培养方法下γδT细胞扩增倍数的比较图；