[发明专利]一种基于大肠杆菌原核表达系统的制备死亡素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到用大肠杆菌的原核表达系统制备死亡素，属于基因工程技术领域。

背景技术

死亡素（thanatin）又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）中发现的，迄今为止在所有已知昆虫抗菌肽中，抗菌谱最广、抗菌活性最强的抗菌蛋白，由21个氨基酸残基组成，结构简单，具有抗肿瘤活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和某些真菌都有抑制作用，对哺乳动物细胞不表现出溶血性。

然而，天然抗菌肽在昆虫体内含量甚微，分离提纯难度大，得率低。而目前的相关研究表明，采用分子生物学和基因工程方法在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物，且易被蛋白酶降解，近期尚不能直接进行工业化生产。因此很有必要对已有的抗菌肽进行结构的修饰加工，或探索一种新型的技术路线进行大规模生产。

发明内容

由于大肠杆菌表达系统具有生长快、遗传背景清晰、表达水平高、产物易纯化、稳定性好、抗污染能力强、适用范围广以及成本低的特点，是理想的外源蛋白表达系统，为了克服现有技术的不足，本发明公开了一种基于大肠杆菌原核表达系统的制备死亡素的方法。

本发明采用了如下技术方案：

本发明提供一种重组基因，包括依次相连的融合伴侣基因序列、甲硫氨酸密码子、死亡素重复序列和终止密码子；死亡素重复序列由1~15个死亡素基因串联而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而来。

作为优选，融合伴侣基因序列前还设有导肽序列，这样翻译出来的重组蛋白主要积累于宿主的周质空间，不会对宿主造成伤害。

作为优选，所述融合伴侣基因序列为多角体蛋白基因从起始密码子开始的90个碱基序列；融合伴侣的作用是促进死亡素的表达，有利于形成包涵体蛋白。

本发明还提供包含上述重组基因的原核表达质粒。

本发明还提供包含上述原核表达质粒的大肠杆菌。

本发明还提供了制备死亡素的方法，包括如下步骤：

（1）诱导如上所述的大肠杆菌内表达重组蛋白；

（2）分离纯化重组蛋白；

（3）用溴化氰处理，将重组蛋白切割成多个独立完整的死亡素；

（4）分离纯化死亡素。

本发明的原理如下：

溴化氰具有专一性裂解甲硫氨酸残基的羧基侧肽键的性质；由于死亡素C末端的最后一个氨基酸残基为甲硫氨酸，内部无甲硫氨酸，另外由于在死亡素重复序列的5端设有甲硫氨酸密码子，故用溴化氰处理重组蛋白能得到多个独立完整的死亡素；而融合伴侣内含有甲硫氨酸，因此被切割成多个小片段，方便与死亡素进行分离。

本发明的创新之处在于，通过溴化氰裂解，可一次性获得多个独立完整的死亡素；为了提高蛋白的表达量，将死亡素和融合伴侣融合表达，这为死亡素快速、有效、大量的制备提供了新思路、新途径，同时为相关领域的科学研究和药物开发等方面奠定了良好的基础，同时还避免了对宿主的毒性作用。

附图说明

图1为重组蛋白SDS-PAGE检测图，其中，Lane M：低分子量蛋白质标准；Lane 1：未诱导空载体；Lane 2：诱导后空载体；Lane 3：未诱导重组菌；Lane4：诱导后重组菌，黑色箭头所示为重组蛋白。

图2为重组基因全序列图：黑框表示的序列分别为甲硫氨酸密码子和终止密码子，二者之间为5重序基因序列；单下划线部分为导肽序列，双下划线部分为多角体蛋白基因从起始密码子开始的90个碱基序列。

具体实施方式

下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。

实验例1 构建重组质粒

化学合成重组基因，包括依次相连的导肽序列、多角体蛋白基因从起始密码子开始的90个碱基序列、甲硫氨酸密码子、死亡素重复序列和终止密码子；死亡素重复序列由5个死亡素基因串联而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而来。重组基因序列见SEQ ID NO：1。

将该重组基因装载于表达载体，得到重组质粒。用Sanger法测序，以验证重组基因序列的正确性。

需要明确说明的是，构建原核表达质粒的方式有多种，是本领域普通技术人员容易做到的，化学合成重组基因后载入表达载体只是其中的一种方式而矣；另外，这里采用5个死亡素基因串联，是为了操作、检测的方便，以现有技术来看，1~15的死亡素基因串联都是允许的。