[发明专利]一种胰蛋白酶的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质检测领域，尤其涉及一种胰蛋白酶的检测方法。

背景技术

蛋白酶能够催化水解靶蛋白中的特异性肽键，涉及调控重要的生理、病理过程。胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的水解酶，可将肽链中赖氨酸和精氨酸残基的羧基端切断，胰蛋白酶在医药、食品及工业生产中均有应用，能溶解变形蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，能使脓液、痰液、血凝块等分解、变稀，加速创面净化，还有抗炎的作用；临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等；胰蛋白酶在促进其他胰腺酶原活化，控制胰腺外分泌功能中具有重要作用；胰蛋白酶的升高是急性酒精性胰腺炎最准确的指示器；胰蛋白酶的缺乏或变异将会引起胎粪性肠梗塞、遗传性胰腺炎等胰腺疾病。因此胰蛋白酶的检测在健康、医药和食品质量控制中具有重要的作用。

现有技术中胰蛋白酶的检测方法主要有荧光法、电化学法、比色法。荧光法一般需要选择合适的荧光标记物，并要对探针进行荧光标记，电化学方法涉及复杂的电极修饰，步骤繁琐。金属与蛋白质结合成为金属纳米簇，当金属纳米簇与胰蛋白酶混合时，金属纳米簇中的蛋白质被胰蛋白酶水解后与金属分离，分离后的金属粒子会发生团聚，溶液的颜色会发生改变，可通过比色来实现胰蛋白酶的检测，如Lin等(Biomaterials，2010，31，6087-6095)将胰蛋白酶底物和1-巯基己醇吸附在金纳米颗粒表面，当胰蛋白酶水解底物，金纳米颗粒的稳定环境被破坏，产生聚集；Zhang等(Analyst，2011，136，3136-3141)基于短的聚精氨酸(Arg6)能够诱导金纳米颗粒聚集，而聚精氨酸被胰蛋白酶水解为小的片段后不能诱导金纳米颗粒聚集。比色方法无需修饰和标记，相对简单，易于操作。

发明内容

本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种利用比色进行胰蛋白酶检测的方法，步骤简单，易于操作。

本发明提供了一种胰蛋白酶检测方法，包括以下步骤：

将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒反应，得到反应产物；

检测反应产物中核-壳型纳米颗粒的吸光值；

检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值；

计算金属纳米粒子的吸光值与核-壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量；

其中，所述的核-壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属纳米粒子形成。

优选地，所述的核-壳型纳米颗粒选自多聚赖氨酸-金纳米颗粒、多聚赖氨酸-银纳米颗粒、多聚精氨酸-金纳米颗粒或多聚精氨酸-银纳米颗粒。

优选地，所述的反应温度为30-40℃。

优选地，所述的反应时间为1-2h。

优选地，所述的反应温度为37℃，反应时间为2h。

优选地，所述的核-壳型纳米颗粒中金属的物质的量与蛋白质的质量比为(5-50)μmol∶(5-50)mg。

优选地，所述的核-壳型纳米颗粒中金属的物质的量与蛋白质的质量比为1μmol∶1mg。

优选地，所述的核-壳型纳米颗粒按照以下方法制备：

将金属离子和蛋白质或多肽混合，得到混合溶液；

将混合溶液放置于50-70℃下孵育0.5-3h。

优选地，所述的混合溶液放置于65℃下孵育3h。

本发明的胰蛋白酶检测方法利用蛋白质或多肽包被金属形成核-壳型纳米颗粒，既作为胰蛋白酶作用的底物，又作为颜色变化的指示剂，未加入胰蛋白酶时，溶液显示的为核-壳型纳米颗粒的颜色，当与胰蛋白酶混合后，核-壳型纳米颗粒表面的蛋白质被水解，核-壳型纳米颗粒结构被破坏，金属核心暴露并发生聚集，形成金属纳米粒子，溶液的颜色发生变化，核-壳型纳米颗粒的颜色变浅，金属纳米粒子的颜色得到显现，利用这两种颜色吸光值的比值表征核-壳型纳米颗粒的减少量，即蛋白质被水解的量，即也表征胰蛋白酶的含量。

本发明的有益效果在于，本发明提供的胰蛋白酶检测方法操作简单，且无需对探针进行修饰或标记。

附图说明

图1是实施例1中制备的核-壳型纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱。

图2是实施例1中制备的核-壳型纳米颗粒的粒径分布图。

图3是实施例1中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。

图4是实施例2中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。

图5是实施例3中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。

图6是实施例5中胰蛋白酶检测的特异性对比图。

具体实施方式