[发明专利]防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及禽类用生物制品技术领域，尤其是一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法。 

背景技术

鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis，DVH）是由鸭肝炎病毒（DHV）引起的一种雏鸭高度致死性、急性传染病。鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)包含嗜肝病毒科、星状病毒科和小核糖核酸病毒科3个病毒科的4种病毒。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎，其对鸭没有显著的致病性；星状病毒科引起Ⅱ型鸭肝炎，目前为止仅英国有发病报道;小核糖核酸病毒科主要引起Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎。 

Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎在临床症状和病理变化上类似，但中和试验和荧光抗体试验证实二者无共同抗原成分，且Ⅲ型鸭肝炎病毒的致病力不如Ⅰ型鸭肝炎病毒。 

Ⅰ型鸭肝炎病毒致死性最强，该病毒呈球形或类球形，直径在20-40nm，无囊膜，无血凝性，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力强，在自然环境中可较长时间存活。由DHV-Ⅰ引起的鸭病毒性肝炎主要侵害1-3周龄雏鸭，发病严重，传播迅速，病程短，临床表现为发病急、死亡快，剖解病变特征主要为肝脏有明显的出血点、出血斑，雏鸭通常在出现症状后1h内死亡，10日龄内的雏鸭感染后死亡率可达90%以上。该病呈世界性分布，首次报道于1945年美国长岛，1954年在英国病鸭中分离到该病毒，德国、意大利、印度、法国、苏联等相继有本病的发生。我国1963年最早报道了该病在上海地区出现，20世纪 80年代初期起本病在我国再次流行，之后北京、福建、浙江等多个地区爆发本病，流行区域广，给我国养鸭业造成了严重损失。 

DHV-III属于小RNA病毒，直径约30nm，但与Ⅰ型鸭肝炎病毒无关，由中和抗体试验和荧光抗体实验证实它们没有共同抗原成分。Toth于1969年在美国长岛首次报道了DHV-Ⅲ引起的鸭病毒性肝炎，我国在1998年由刘兆宇等报道了Ⅲ型DHV感染的发生。该疾病不如Ⅰ型鸭肝炎病毒感染严重，雏鸭的死亡率很少超过30%，但大体病变与Ⅰ型鸭肝炎病毒引起的相似。 

近年来我国不断从病鸭中同时分离到DHV-Ⅰ和DHV-III，证明相当多地区的鸭病毒性肝炎为DHV-Ⅰ和DHV-III的混合感染，且混合感染的病死率高于任何一种的单一感染，而治愈率低于任何一种的单一感染；而现有的鸭病毒性肝炎疫苗、高免血清或高免卵黄抗体绝大多数是针对Ⅰ型鸭肝炎病毒研制的，因此对于DHV-III单一感染及DHV-Ⅰ和DHV-III混合感染的治疗效果均不理想，给鸭病毒性肝炎的防治带来了新的挑战。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种稳定性好、治疗效果明显、特异性强、制备安全方便的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎单一感染及混合感染的二价蛋黄抗体的制备方法。 

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤： 

1.制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋 

（1）选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染； 

（2）制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒二价灭活苗 

A.制水相 

用冷冻保存的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚，24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相； 

B.制油相 

取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相； 

C.制备油乳剂灭活苗 

将上述步骤1-（2）-A所制得的水相和步骤1-（2）-B所制得的油相进行混匀即得； 

（3）免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋 

将步骤1-（2）所制备的二价灭活苗免疫步骤1-（1）处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序，待效价检测均达到要求后收集鸡蛋，即为Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋； 

2.利用步骤1制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体 

（1）分离高免鸡蛋蛋黄 

将步骤1制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； 

（2）提取卵黄抗体