[发明专利]一种纯化硫代寡核苷酸的工业化方法

说明书

技术领域：

本发明涉及寡核苷酸加工方法，特别是一种纯化硫代寡核苷酸的工业化方法。

背景技术：

现有纯化硫代寡核苷酸方法多处于实验室生产或小规模生产，其方法为：

1、本工艺采用中低压离子交换层析法纯化目的物。纯化系统由自动液相层析仪和离子交换纯化柱组成。自动液相层析仪配有多元梯度泵、流动相自动切换系统、在线紫外监测器和pH监测器；纯化柱是体积1ml的预装阴离子交换柱，柱填料为强阴离子交换材料季铵化的聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物。

原理：在离子交换层析中，溶质依据所带电荷的不同及其与离子交换填料静电作用力的差异而获得分离。硫代寡核苷酸分子骨架上的硫代磷酸基团带有负电荷，链长度不同则所带电荷数不同。基于这种特点，可以使用阴离子交换色谱柱将不同长度的硫代寡核苷酸分离。

2、对上道合成硫代寡核苷酸工序的中间产品需要进行纯化，中间产品作为原料液进行过滤，去除固体基质，取清液作为上样原料液；

3、纯化层析体系选择：硫代寡核苷酸将使用10%乙腈—氯化钠溶液进行浓度梯度洗脱。

原理：随着氯离子浓度的增大，不同电荷数的硫代寡核苷酸从强阴离子交换树脂上依次洗脱，得到分离纯化。本方法的主要不足在于整个洗脱过程溶液的pH值偏低，过程中会产生核酸链自身互补形成二级结构的可能，并有核酸聚集成团，从而造成目的组分损失。

4、上样和分离、洗脱：起动纯化仪，开始在线监测。每次纯化上样量1ml，含目的物约1mg。具体层析纯化操作如下：10%乙腈水溶液—10%乙腈+2mol氯化钠溶液作为流动相，线性梯度洗脱，流速：0.5ml/min。

5、在线监测260nm处紫外吸收峰。收集最大吸收峰处的组分。洗脱时，当主组分峰上升到90%时开始收集，下降到80%时停止收集，可以得到纯度较高的产物。

原理：寡核苷酸在260nm处有最大吸收峰。

6、完成一次纯化过程，可得到ug量级的目的物，纯度>90%，得率约30%。

上述生产方法的缺陷在于：不能大规模工业化生产，目的物纯度低，得率低。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种纯化硫代寡核苷酸的工业化方法。

本发明的方案是：生产设备包括自动液相层析仪和离子交换纯化柱，自动液相层析仪配有多元梯度泵、流动相自动切换系统、在线紫外监测器和pH监测器；包括纯化层析体系选择；生产步骤包括：⑴原料液处理，⑵在线监测，⑶上样、分离、洗脱，⑷目的组分收集，其特征在于：自动液相层析仪器的纯化柱为直径100mm的不锈钢柱，装填层析填料1000ml；流动相组成：A：20mM氢氧化钠水溶液、B：20mM氢氧化钠+2.5M氯化钠水溶液；

生产步骤(2)起动纯化仪，开始在线监测，选择紫外监测器的紫外波长为290nm；

步骤(3)上样、分离、洗脱：每次纯化上样量为上样原料液150ml；

其分步骤为：

分步骤①用液量为1个层析柱体积的流动相A液平衡层析柱，然后以100ml/min快速上样；

分步骤②用80%-60%流动相A液、20％－40％的流动相B液进行洗脱，液量为6个层析柱体积，洗脱过程流速为120ml/min；

分步骤③用60%-20%流动相A液、40％－80％的流动相B液进行洗脱，液量为4个层析柱体积，同时开始分段收集紫外最大吸收峰处的洗脱液，洗脱过程流速为120ml/min；

分步骤④用20%流动相A液、80％的流动相B液进行洗脱，液量为1个层析柱体积，洗脱过程流速为120ml/min；

步骤（4）生产中分段收集的各组分，经高效液相色谱测定，纯度＞95％以上的样品组分可混合进入后续脱盐工序，最终得到目的产物。

本发明的优点在于：

1、现有纯化条件下，一次可以完成约10克目的产物的纯化，产率可达理论量的70％。

2、多批纯化脱盐样品，经反相高效液相色谱法检测，纯度均大于95％。

3、经核磁共振法测定磷谱，样品未全硫代物均未检出（表明产物全硫代率高，未全硫代的失败物被完全分离去除）。

具体实施方式：

本工艺采用中低压离子交换层析法纯化目的物。纯化系统由自动液相层析仪和离子交换纯化柱组成。自动液相层析仪配有多元梯度泵、流动相自动切换系统、在线紫外监测器和pH监测器；纯化柱为大不锈钢柱，直径100mm，装填层析填料1000ml；层析分离用柱填料为强阴离子交换材料聚苯乙烯二乙烯基苯的季铵盐化合物。