[发明专利]β-Catenin基因突变的快速检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。

背景技术：

β-链蛋白（β-Catenin；CTNNB1）是一种具有介导细胞粘附及信号传导双重活性的多功能的蛋白质（Bauer and Willert,2012），除少数游离存在于细胞浆中外，主要位于细胞膜。β-catenin蛋白的分子量约为90kDa，由约800个氨基酸组成；其分子结构主要分三个区域：氨基端可使得β-Catenin在翻译后能保持分子稳定，羧基端则负责激活靶基因的转录，而另一个ARM区域因结构紧密可防止蛋白水解，是β-Catenin与其配体相互作用的基础。β-链蛋白在细胞连接处与钙粘素相互作用，参与形成粘合带，发挥细胞粘附分子和细胞骨架成分的作用；而胞浆中游离的β-Catenin则进入细胞核而调节基因表达（Barker et a.,2001），即作为Wnt/β-Catenin信号通路的关键成员介导信号转导过程中调控细胞的增殖和凋亡（Masiello et al.,2004），其异常表达或激活则能引起肿瘤发生（Chitalia et al.,2008）。

现有研究成果提示，β-Catenin基因发生突变时可能导致其获得额外的功能而活化，进而引起肿瘤发生；如约85％的硬纤维瘤患者被查有β-Catenin基因突变（Lazar et al.,2008），其它肿瘤如结直肠癌（Morin et al.,1997）、卵巢癌（Sagae et al.,1999）、肝细胞癌（Legoix et al.,1999）等也都发现与β-Catenin基因体细胞突变相关。

高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法。使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。

SYBR^TM Green I对PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。

罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green，它有三个优点：饱和染料毒性低；高浓度可以使DNA达到饱和；降低了染料位置重组的可能。

而PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求包括:

仪器:高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响

试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线

软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件

罗氏荧光定量PCR系统LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。

LightCycler Nano System是LightCycler 480System的缩小版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子10分以上5篇，包括Nature,Nature Methods,NatureGenetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实Β-CATENIN基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。

发明内容：

本发明要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。