[发明专利]一种高纯度达托霉素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及工业微生物技术领域，具体的说是一种高纯度达托霉素的制备方法。

背景技术

达托霉素是脂肽类家族的一员，属于环十脂肽结构群，由玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）发酵而得，是目前全球首个成功开发的环脂肽类抗生素。达托霉素结构新颖，杀菌机制独特，能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，并杀死革兰氏阳性菌，特性表现为抑制作用迅速、体内与体外杀菌作用所需的浓度低，抗生素作用的有效性时间长。达托霉素的化学式为C₇₂H₁₀₁N₁₇O₂₆，分子量为1620.67，其结构式如下：

达托霉素由美国礼来公司于20世纪80年代末发现，1997年Cubist公司获得了达托霉素的全球独家开发、生产及销售权。Cubist公司经过长达六年的体外试验证实达托霉素对多重耐药革兰氏阳性菌有快速有效的浓度依赖性杀菌作用。在临床上与万古霉素相比表现出抗菌谱广、药效快、给药量少、毒副反应轻等优点，是目前世界上公认的万古霉素等现用抗生素的最佳替代品。此外更重要的是，达托霉素在体外对已呈现甲氧西林、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株如耐甲氧西林金葡菌、糖肽类敏感的金葡菌、耐青霉素类肺炎链球菌）等均有高效低毒的杀菌效果，并且用药次数少，治疗成本低。

2003年FDA批准了达托霉素注射剂用于治疗由革兰氏阳性菌所致的复杂皮肤和软组织感染，以及金葡菌引起的菌血症和右侧心内膜炎，其安全性和耐受性好，是一种应用前途广阔的抗生素。

目前，关于高纯度达托霉素制备方法的报道不多。美国卡比斯特制药公司申请的中国专利CN1404487公开了一种用阴离子树脂纯化达托霉素的方法，该方法交替使用阴离子树脂FP-DA13、大孔树脂HP-20SS、阴离子树脂PorosD50或Poros 150对达托霉素进行分离提纯，可以得到纯度98%的达托霉素产品，但该工艺繁琐，且成本高，难于实现工业化规模生产。中国专利CN101830970A和CN102276696A在CN1404487基础上进行了工艺改进，CN101830970A是采用缓冲溶液将达托霉素粗品配成样品溶液，然后上复合型YT-01反相硅胶材料柱吸附，再用强极性溶剂的水溶液作解吸剂进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱；CN102276696A是将半纯化的达托霉素加载结合到凝胶型弱阴离子树脂后进行洗脱。这两个专利技术虽然简化了流程、降低了成本，但仍难以实现工业化生产。达托霉素难以实现规模化生产，一是因为没有好的工业化生产菌种，二是因为没有合适的工业化后提取技术。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉，适于工业化规模生产的高纯度达托霉素的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种高纯度达托霉素的制备方法，包括对达托霉素发酵液的滤液进行粗提的步骤、精提的步骤，所述粗提是将达托霉素发酵液的滤液导入大孔吸附树脂进行吸附，用解吸剂对大孔吸附树脂进行梯度解吸，然后对解吸液进行减压浓缩、结晶、干燥，得到达托霉素粗品，粗品的HPLC含量为90%左右；所述精提是将达托霉素粗品用极性溶剂溶解，然后将所得的溶解液注入聚合物纳米微球柱进行层析分离，再用洗脱剂对聚合物纳米微球柱进行梯度洗脱，并收集HPLC含量大于等于98.5%的洗脱液，再将此洗脱液减压浓缩、结晶、干燥，得到HPLC含量大于等于98.5%的达托霉素。

本发明的进一步改进在于：所述达托霉素发酵液的滤液的制备是向达托霉素发酵液中加入助滤剂，经搅拌混合后对达托霉素发酵液进行过滤，而制得达托霉素发酵液的滤液。

本发明的进一步改进在于：上述助滤剂的用量为每100L达托霉素发酵液中加入0.5kg ~ 5kg助滤剂。优选为1 kg ~3 kg。

本发明的进一步改进在于：上述助滤剂为珍珠岩或硅藻土的其中一种或者其混合物。

本发明的进一步改进在于：所述大孔吸附树脂为LX-50、D113或D312树脂的其中一种。优选为D312树脂。

本发明的进一步改进在于：对大孔吸附树脂进行梯度解吸的解吸剂的体积百分浓度分别为30%～40%和70%～75%。

本发明的进一步改进在于：所述聚合物纳米微球为UNIPS30RPC。