[发明专利]鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用引物体系

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及鹿、猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，适用于上述八种动物血液制品的快速检测及鉴定，尤其适用于鹿血液制品的快速防伪鉴定。

背景技术

鹿血为鹿科动物的血液，据《本草纲目》记载：“鹿血大补虚损，益精血，解痘毒、药毒”。鹿血作为传统的珍贵中药材具有不可替代性，其药用价值一直以来得到广泛认可和深入开发，产品系列不断丰富，包括鹿血酒、鲜鹿血、鹿血晶等，所产生的市场价值和需求十分巨大。在经济利益的驱使下，不法分子常常会利用其它常见动物血液假冒鹿血，或在鹿血产品中掺入其他常见动物血以次充好来降低成分，常用的动物血液为猪、牛、羊、马、驴、兔和鸡的血液。但目前鹿血的品质检测一直没有很好的手段，传统目测及理化分析方法无法有效地判别这些性质十分相似的血液样品。为了确保鹿血的真实度和纯度，从源头上控制鹿血的品质，开发用于鉴别常见物种血液样品的简便快速的现代分子生物学检测技术具有迫切性和必要性。

聚合酶链式反应（PCR）技术具有响应快速、灵敏度高且特异性好的优点，是当前应用最广的先进分子生物学技术，该技术利用特异的引物可以从微量样品中扩增出相应特定的DNA片段，达到放大核酸信号的目的。同时，PCR具有非常高的反应特异性，可以区分少至几个核苷酸碱基的差异，因此PCR技术在诊断性检测领域得到广泛深入的应用。由于在进化过程中不同物种的遗传物质DNA存在序列上的保守性和多变性，尤其在物种内部具有较高的保守性，而物种之间存在较大的差异性。利用PCR技术上述的高度灵敏性和特异性，可以区分不同物种材料，尤其是具有较高经济价值的产品。而线粒体DNA相对基因组DNA具有更高的突变率和遗传多变性，因此线粒体DNA序列的差异常用于不同物种及物种内部的进化分析及诊断检测。

目前国内外针对上述报道的文献较少，且大多是针对少量物种进行的。如Dalmasso A等人为抑制疯牛病传播，防止在其他产品中掺入牛制品，利用多元PCR技术鉴定饲料中动物成分，使用了四对引物分别针对反刍动物、家禽、鱼和猪，引物设计时针对的基因为：12S rRNA，tRNA Val及16S rRNA（Dalmasso A, Fontanella E, Piatti P, Civera T, Rosati S, Bottero MT, A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes, 2004, 18: 81-87.）。Ghovvati, S.等人为鉴定工厂肉制品中是否掺假，防止伊斯兰教食品中掺入猪肉制品，设计了分别针对反刍动物、家禽及猪的三对引物，引物设计时针对的基因为：12S rRNA及16S rRNA（Ghovvati,S., M.R. Nassiri, S.Z. Mirhoseini, A.H. Moussavi, A. Javadmanes, Fraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay. Food Control, 2009,20:696-699.）。又如Dai-Ming Zha等人为检测鹿产品中的掺假情况，设计了四对分别针对牛、羊、家禽和猪的引物，引物设计时针对的基因为：tRNA Val和16S rRNA（Dai-Ming Zha, Xiu-Mei Xing, Fu-He Yang, A multiplex PCR assay for fraud identification of deer products, Food Control, 2010,21:1402-1407.）。但上述方案并未设计针对鹿的引物，因此虽然能测定样品中是否含有这四类物质，但不能确定是否是鹿产品。

由以上具有代表性的研究结果可以看出，这些检测存在下列不足：（1）检测范围窄，一次只能检测少量物种，基本不会大于四个。这是由于在同一个总DNA模板体系中，引物对的数量越多，引物对与总DNA模板之间的相互干扰越严重，PCR反应的特异性也越不能保证；（2）没有建立对大量常见物种的快速且特异性高的引物体系及检测方法，这也会造成漏检现象。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用引物体系，该引物体系及用该引物体系进行的鉴定方法可快速且特异性高的检测鹿猪牛羊马驴兔鸡血液制品的真伪及其是否有掺假，尤其适用于鹿血产品鉴定与检测，其对常见物种的检测覆盖面广泛。