[发明专利]一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，还涉及一种利用鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法。

背景技术

鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus,SVCV），属单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales），弹状病毒科(Rhabdoviridae)，水泡性口炎病毒属(Vesiculovirus)的暂定种，目前仅有一个血清型。SVCV引起的鲤春病毒血症(Spring Viraemia of Carp，SVC)是一种急性、出血性并有高度传染的流行病，严重危害渔业生产并能造成毁灭性打击。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报的重要疫病。2008年我国新颁布的动物疫病名录中将其列为一类动物疫病，是新中国成立以来第一个也是唯一一个鱼类病毒疫病被列为一类传染病。

SVC对水产养殖特别是鲤科鱼类养殖的危害巨大。由于暂时没有较好的防治药物和方法，对该病的防控需要依赖实验室的诊断，因此建立快速准确的检测方法至关重要。SVCV检测的“金标准”是通过细胞培养分离病毒，利用免疫学技术或分子生物学技术进行鉴定，这个过程耗时长，程序复杂。另外制备高效价抗血清困难，也限制了免疫学方法的使用。OIE水生动物疾病诊断手册、我国关于SVCV检测的国标和行标，已经将RT-PCR列为诊断方法。在现有的关于RT-PCR检测SVCV的公开文献中，绝大多数是采用传统的两步法RT-PCR技术，即将反转录和PCR反应分管分步进行。RT-PCR检测病原在近年来越来越趋向于采用一步法进行反应。与两步法相比，简化了操作程序、降低了样品交叉污染的可能性，对反应的干扰因素少，能获得良好的重现性，又降低了成本，为开发同时检测多种病原的多重RT-PCR创造了有利条件。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，通过分析比对GenBank中已有的鲤春病毒血症病毒G基因序列（AY527273,EF593133至EF593150,AY842484至AY842489,DQ227500至DQ227504,EU370915,Z37505），设计并筛选了一对引物，从分子水平对鲤春病毒血症病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种利用鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法。，本方法可在3小时内准确检测出样品中的SVCV，能检测SVCV感染的病鱼组织，也能检测SVCV感染的细胞（例如EPC细胞），非常适用于SVCV的快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：5×AMV buffer，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)，MgCl₂，dNTPs，引物SVCVF和SVCVR，AMV酶，Taq酶。

SVCVF:5’-ggaatccccatatttgttccatc-3’；

SVCVR:5’-tcacaagttgttttccattcagc-3’；

一种利用鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，其步骤是：

1、病毒RNA的获取：

采用或LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。

2、RT-PCR扩增：

采用25μl反应体系：在PCR管中加入预处理的核酸模板5μL，5×AMV buffer 1μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2μL，MgCl₂(25mM)0.5-3μL，dNTPs(25mM)0.5μL，引物(10μM)各0.5μL，AMV酶0.5μL，Taq酶0.5μL，补加灭菌水至25μL。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45℃30min，95℃3min，再按95℃20s-55℃20s-72℃20s作35个循环，最后72℃延伸5min，4℃下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。

模板RNA在95℃5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。

3、检测结果判定：