[发明专利]用于多态性的高通量鉴定和检测的策略

说明书

本申请是申请日为2006年6月23日、申请号为200680025630.8的同名申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分子生物学和遗传学领域。本发明涉及快速鉴定核酸样品中的多个多态性。经鉴定的多态性可以用于针对测试样品中的多态性的高通量筛选系统的开发。

背景技术

长期以来，基因组DNA探查被科学团体特别是医学团体所期望。基因组DNA是鉴定、诊断和治疗疾病，例如癌症和阿尔兹氏疾病的关键。除疾病鉴定和治疗以外，基因组DNA的探查可以在植物和动物育种研究中带来显著的优势，其可以对全世界的食品及营养问题提供答案。

已知许多疾病与特定的基因元件有关，特别地，与特定基因中的多态性有关。大量样品例如基因组的多态性的鉴定，在目前是一项艰苦而耗时的工作。然而，该鉴定对于下述领域例如生物医学的研究，开发药学产品、组织分型、基因分型和群体研究具有重大价值。

发明概述

本发明提供了使用高通量方法的组合以快速而经济的方式在复杂的例如非常大量的核酸样品（例如DNA或RNA）中，有效地鉴定并且可靠地检测多态性的方法。

这种高通量方法的整合提供了一种平台，其特别适用于高度复杂的核酸样品中的多态性的快速且可靠的鉴定和检测，其中传统的多态性的鉴定和绘图是艰苦且耗时的。

本发明人的发现之一是用于多态性，优选单核苷酸多态性的鉴定的解决方案，而且同样可用于（微）卫星和/或插入/缺失特别是在大基因组中（微）卫星和/或插入/缺失的鉴定的解决方案。该方法的独特之处在于它对大的或小的基因组的适用性相同，并且对大基因组特别是多倍体物种尤其具有优势。

为了鉴定SNP（和随后检测经鉴定的SNP），本领域有几种可以采用的可能方法。首选方案中，对完整基因组进行测序，并且这可以对几个个体进行。这主要是理论上的实验，因为这是麻烦而且昂贵的，并且，尽管技术快速发展，这虽然简单但对用于每一个生物体是不可行的，尤其是对具有大基因组的生物体是不可行的。次选方案是利用可获得的（片段化的）序列信息，例如EST文库。其允许生成使PCR引物，重新测序和个体间的比较。此外，其要求初始的序列信息不可得或仅仅是有限量的。进一步必须开发分别针对各个区域的PCR-分析，其增加了巨大的成本和开发时间。

第三个选择是限定自身到各个个体的基因组的部分。困难在于，为了提供用于成功的SNP鉴定的可比较的结果，所提供的基因组的部分必须对不同个体是相同的。本发明人现在已经解决了这一难题，通过整合用于筛选部分的基因组的高度重现性方法集合和用于多态性鉴定的高通量测序，其整合于样品制备和高通量鉴定平台。本发明加速了多态性发现的进程并且在后续的用于所发现的多态性开发的过程中，使用相同的要件（element）可以有效且可靠地进行高通量的基因分型。

进一步设想的本发明的方法的应用，包括筛选富集的微卫星文库，进行转录作谱cDNA-AFLP（数字化Northern）、复杂基因组的测序，EST文库测序（对完整cDNA或cDNA-AFLP）、微小RNA发现（小的插入文库的测序）、细菌人造染色体（BAC）（重叠群）的测序、批量分离分析法AFLP/cDNA-AFLP、AFLP片段的常规检测，例如，标记辅助的回交（MABC）等等。

定义

在下面的描述和实施例中使用了大量术语。为了提供对说明书和权利要求包括这些术语给定的范围的清楚而一致的理解，给出下面的定义。除非在此另有定义，此处所有使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。所有出版物、专利应用、专利和其他参考文献的公开内容以其整体作为参与引入此处。

多态性：多态性指群体中核苷酸序列存在的两个或多个变体。多态性可以包含一个或多个碱基置换、插入、重复或缺失。多态性包括，例如，简单的序列重复（SSR）和单核苷酸多态性（SNP），其是一变异，发生于当单核苷：腺嘌呤（A），胸腺嘧啶（T），胞嘧啶（C）或鸟嘌呤（G）-改变时。变异必需在群体中通常出现至少1%才被认为是SNP。SNP构成例如所有人类遗传变异的90%，并且在人类基因组中每100至300个碱基就有发生。每三个SNP中的两个是胸腺嘧啶（T）取代胞嘧啶（C）。例如人或植物的DNA序列中的变异可以影响它们如何应对疾病、细菌、病毒、化学制品、药物等。