[发明专利]一种提取银耳多糖和银耳蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种银耳多糖和银耳蛋白的提取方法，特别涉及采用双水相萃取体系提取银耳多糖和银耳蛋白的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

银耳（Tremella fuciformis Berk）是一种食药两用菌，含有丰富的多糖和蛋白质等物质。银耳多糖是银耳的主要活性物质，包括酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类。银耳多糖具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖和降血脂等多种生理功能；银耳蛋白质含有17种氨基酸，能提供人体所必需的氨基酸中的3/4。银耳多糖以其丰富的原料来源、独特的生物学功能和良好的食用安全性，近年来在天然功能性食品添加剂、医药保健品、日用化妆品等领域越来越来受到重视，具有广泛的开发应用前景。

银耳多糖可以从银耳子实体中提取获得，也可通过银耳分生孢子发酵生产。银耳子实体的生产存在着培养周期长、产量低、不易规模化生产等缺点，而银耳孢子液体发酵法具有原料来源广泛、产生的活性物质多、发酵周期短、生产成本低、易于实现工业化的特点，因而发酵法生产银耳多糖正逐步取代银耳子实体提取法。

从银耳子实体或孢子中提取银耳多糖的方法主要有热水浸取法、溶剂提取法、酶溶提取法等，这些方法是通过破坏银耳细胞而使胞内多糖溶出，得到的粗多糖中含有大量的蛋白质，为提高多糖纯度，还需要再采用sevag法（氯仿和正丁醇沉淀法）除去多糖中的蛋白质。以上的提取方法或者存在提取效率较低、有溶剂残留，或者存在设备要求高、能耗高、成本高、多糖纯度低、多糖易变性失活等问题。

双水相萃取技术是近年来发展起来的生物分离技术，是分离纯化生物活性物质的有效方法。双水相系统是指两种不同种类的聚合物水溶液混合或者一种聚合物水溶液和一种盐溶液混合后，当两者浓度达到一定值时，混合液静置后分层产生的两液相系统。双水相系统萃取的原理是基于生物物质在体系中的选择性分配。双水相萃取具有操作条件温和、处理量大、分离步骤少、能耗低，无有机溶剂残留，易于工业化操作等优点。目前在生化分离工程中常用的双水相体系是聚合物/聚合物体系以及聚合物/无机盐体系，最常用的体系为聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）体系以及聚乙二醇（PEG）/无机盐体系。

如中国专利文献CN101693735A（申请号200910309154.8），公开了一种双水相萃取分离蛋白质和酶的方法，其特点在于将多元醇与无机盐按比例直接加入到蛋白质或酶溶液中，搅拌均匀，室温下静置，形成两相，蛋白质或酶主要分配到上相，且保留较高的活性，从而达到有效的分离提取目的。

采用双水相体系同步提取银耳多糖和银耳蛋白质的方法尚未见报道。

发明内容

针对目前银耳多糖和银耳蛋白提取方法的不足，本发明的目的在于提供一种工艺简单、多糖收率高、成本低，便于规模化生产的提取银耳多糖和银耳蛋白的方法。

本发明的方法是利用双水相体系提取银耳多糖和银耳蛋白，从而降低生产成本，达到较好的经济效果。

为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：

一种利用双水相体系提取银耳多糖和银耳蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）将银耳菌接种到斜面培养基上，在24～26℃下活化培养6~8d，然后将银耳孢子接入到液体种子培养基中，在150~200r/min、24～26℃下培养3~5d，制得液体种子；将液体种子按5～10wt%的接种量接入液体发酵培养基中，在温度24～26℃、150～200r/min条件下，培养4～6天，制得发酵液；

（2）将步骤（1）制得的发酵液采用截留分子量为3000～6000Dal的超滤膜浓缩，截留液为含有银耳孢子和胞外多糖的浓缩液，破碎银耳孢子，得到银耳孢子破碎液；

（3）在20~30℃下，配制无机盐水溶液，向该无机盐水溶液中添加聚乙二醇，在总体系中无机盐质量百分比浓度为10～30%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为10%～30%，混合均匀，制得聚乙二醇/无机盐双水相体系；

（4）向步骤（2）制得的银耳孢子破碎液中按体积比1:（1～5）加入步骤（3）制得的聚乙二醇/无机盐双水相体系，搅拌10～30min混匀后，静置5～15min分相，制得无机盐下相和聚乙二醇上相；

（5）将步骤（4）制得的无机盐下相离心分离，取上清液，采用截留分子量为3000～6000Dal的超滤膜浓缩，截留液经冷冻干燥后，制得银耳多糖；