[发明专利]多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。

背景技术

PIK3CA基因编码PI3激酶，该PI3激酶调节对肿瘤形成起着重要功能的信号通路。已知肿瘤组织中常见PIK3CA基因的突变，其中尤其是G1624A(E542K)突变、G1633A(E545K)突变以及A3140G(H1047R)突变被高频率被发现(例如参见Science.(2004)Apr23；304(5670)：554(非专利文献1)以及Oncogene.(2005)Feb17；24(8)：1477-80(非专利文献2))。

在上述三处存在突变的情况下，报告了不能获得以西妥昔单抗(其被用作不能切除的大肠癌的治疗药)为代表的抗EGFR抗体药的效果(例如，Cancer Res.(2009)；69：(5).March1，2009(非专利文献3)、BMC Cancer.(2011)Mar25；11：107(非专利文献4))。

西妥昔单抗之类的分子靶向药非常昂贵，而且有可能产生间质性肺炎等严重的副作用。因此，在给药前测定与药效相关的基因突变，对能够期待药效的患者选择性施与药剂是极为重要的。这种准确且短时间、低成本、简便地测定基因突变的方法备受期待。

目前，作为测定基因的多态性的方法，已知通过PCR法扩增含有突变的区域之后，使荧光染料标记的核酸探针与靶标核酸杂交，测定荧光染料的发光的减少量，基于熔解曲线分析结果来分析碱基序列的突变的方法(参见日本专利文献特开2002-119291号公报(专利文献1))。

发明内容

发明要解決的课题

在非专利文献1和非专利文献3中，通过直接测序法来检测PIK3CA的突变。但是，直接测序法中，在进行PCR之后，必须进行测序反应，通过测序仪进行电泳等，需要工夫和成本。另外，由于要处理扩增产物，因此扩增产物有可能混入下一反应体系中。

在非专利文献2中，结合PCR-SSCP(单链构象多态性，Single Strand Conformation Polymorphism)法和直接测序法来检测PIK3CA的突变。但是，在PCR-SSCP法中，在进行PCR之后需要对扩增产物进行电泳，需要工夫和成本。另外，由于需要处理扩增产物，扩增产物有可能混入下一反应体系中。

在非专利文献4中，使用QIAGEN的试剂盒通过Scorpion ARMS法来检测PIK3CA的突变。但是，Scorpion ARMS法需要购买试剂盒。另外，除试剂盒之外，还需要另外的实时PCR装置，需要成本。而且，对每个突变都需要不同的试剂和反应管，需要工夫和成本。

专利文献1中通过使用核酸探针的方法来检测多态性。但是专利文献1中，关于核酸探针的设计，仅给出如下启示：将核酸探针设计为末端部用荧光染料标记的淬灭探针在与靶标序列杂交时，末端部分中形成的核酸探针和靶标序列的杂交体的多个碱基对至少形成一个G和C的对。因此，在专利文献1中记载的方法中，需要使用具有对每个突变型都适当的序列的核酸探针。

另外，通过本发明者的研究，弄清了在核酸探针的序列中，如果GC含量过高，则淬灭探针不会充分起作用。

由于这些现状，人们期待着用于检测PIK3CA基因多态性的进一步的技术开发。

本发明的课题在于，提供能够高灵敏度、简便地检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针、使用其的多态性检测方法。另外，本发明的课题在于，提供使用该多态性检测方法的药效判定方法。而且，本发明课题在于，提供使用该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。

用于解决课题的手段

本发明者获得了如下见解：通过基于含有PIK3CA基因的多态性的特定区域来设计淬灭探针，通过使用淬灭探针进行熔解曲线分析能够检测PIK3CA基因的多态性。本发明是基于相关见解而实现的。

本发明如下所述。

<1>一种多态性检测用探针，其用于检测PIK3CA基因的多态性，所述多态性检测用探针为选自下述P1～P11’的至少一种荧光标记寡核苷酸，

(P1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；