[发明专利]一种重组牛朊蛋白bPrP及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组牛朊蛋白bPrP其氨基酸序列为：

a）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

b）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述重组牛朊蛋白bPrP的基因，是如下a)或b)：

a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；或

b）由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码bPrP的核苷酸序列。

3.一种重组表达载体，其为含有权利要求2所述基因的表达盒。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其为pPROEX-htb-bPrP。

5.含有权利要求3或4所述重组表达载体的细胞系及重组菌。

6.一种构建权利要求4所述重组表达载体的方法，包括以下步骤：1）PCR方法扩增bPrPc基因；

2）将PCR产物和载体pPROEX-htb分别用内切酶BamHI和Hind III双酶切；酶切产物连接后转化感受态细胞，挑取阳性菌落，得到前期表达质粒；

3）以前期表达质粒为模板，以除去bPrPc基因前的酶切位点为目的设计引物，进行PCR反应，将PCR产物转化感受态细胞，选取阳性菌落提取质粒，得到重组表达载体pPROEX-htb-bPrP。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤1）所述的PCR方法中所用的引物序列分别为：

上游引物：cgcGGATCCCTCTGCAAGA AGCGACC，划线部分为保护碱基及BamH I酶切位点,

下游引物：cccAAGCTTATGCCCCTCGT TGGTAAT，划线部分为保护碱基及Hind III酶切位点；

50μL反应体系为：10×Buffer 5μL，dNTP4μL，牛全血基因1μL，上、下游引物各2μL，ddH₂O 35μL，高保真DNA聚合酶1μL；

PCR反应条件为：98℃预变性5min：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min。

8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤3）所述引物为：

P1：GAAAACCTGTATTTTCAGGGCAAGAAGCGACCAAAACCTGGAGG

P2：CCTCCAGGTTTTGGTCGCTTCTTGCCCTGAAAATACAGGTTTTC；

50μL反应体系为：10×Buffer 5μL，dNTP4μL，前期表达质粒1μL，P1、P2各2μL，ddH₂O 35μL，高保真DNA聚合酶1μL；

PCR反应条件为：98℃预变性5min：94℃变性40s，65℃退火30s，72℃延伸2.5min，18个循环；72℃延伸10min。

9.一种制备权利要求1所述重组牛朊蛋白bPrP的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将权利要求3或4所述重组表达载体转化入感受态细胞，制得牛朊蛋白bPrP表达工程菌；

2）将牛朊蛋白bPrP表达工程菌经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛朊蛋白bPrP；

3）将纯化的牛朊蛋白bPrP复性后加入rTEV内切酶，切除组氨酸标签，然后再次通过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱除去组氨酸标签和重组rTEV酶，将洗脱收集的液体超滤浓缩，得到重组牛朊蛋白bPrP，。复性后的蛋白就有生物学活性。

10.含有权利要求1所述的重组牛朊蛋白bPrP的检测试剂盒或诊断试剂。