[发明专利]一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法

权利要求书

1.一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，其特征在于快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，按以下步骤进行：

一、使用试剂盒提取待分析样品的DNA；

二、特异性PCR扩增：以样品的DNA为模板，以Pla46F和630R为引物，进行第一次PCR扩增，获得扩增产物A，将扩增产物A经DNA纯化试剂盒纯化，获得纯化产物，然后以纯化产物为模板，以AMX368F和AMX820R为引物，进行第二次PCR扩增，获得扩增产物B；

三、限制性内切酶酶切：将扩增产物B经1U的绿豆核酸酶消化30min，消化后的扩增产物B采用PCR产物纯化试剂盒纯化，然后使用MspI和RsaI对纯化的扩增产物B进行双酶切，获得酶切产物；

四、酶切产物纯化：向酶切产物中加入1μL 3mol/L、pH为5.2的NaAc溶液和20μL-20℃、体积浓度为96％的乙醇溶液，然后于10000rpm离心，弃上清，向沉淀中加入体积浓度为70％的乙醇溶液清洗，然后于10000rpm离心，取沉淀，干燥后加入5μL灭菌超纯水溶解沉淀；

五、毛细管电泳：将1μL步骤四中溶解的沉淀、9μL甲酰胺和0.25μL DNA分子量内标-500混匀后，用DNA测序仪进行毛细管电泳，电泳程序：①变性，90℃，120sec；②进样，2.0kV，30sec；③分离，5.0kV，60℃，60min，电泳结果即为酶切后末端片段的长度；

六、毛细管电泳结果分析：依据下述对应关系，

将DNA测序仪获得的电泳结果数据采用GeneMapper 4.0进行分析，即获得厌氧氨氧化菌群分析结果；其中步骤二中引物Pla46F为5’-GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物630R为5’-CAKAAAGGAGGTGATCC-3’，引物AMX368F为5’-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3’，引物AMX820R为5’-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3’。

2.根据权利要求1所述的一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步骤二中第一次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：10～50ng样品的DNA、1μL引物Pla46F、1μL引物630R、5μL 10×Buffer、4μL dNTPs、1μL Taq酶和余量的ddH2O；PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。

3.根据权利要求1所述的一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步骤二中第二次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：10～50ng纯化产物、1μL引物AMX368F、1μL引物AMX820R、5μL 10×Buffer、4μL dNTPs、1μL Taq酶和余量的ddH₂O；PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。

4.根据权利要求1所述的一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步骤三中双酶切反应体系为10μL，由下列成分组成：1μL MspI、1μL RsaI、1μL Buffer和7μL纯化的扩增产物B，酶切反应条件为37℃反应3h，然后置于65℃20min终止反应。