[发明专利]一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA疫苗载体及其制备方法和应用，特别设计一种可用于预防羊传染性脓疱的DNA疫苗载体及其制备方法和应用，属于生物药物领域。

背景技术

羊传染性脓疱（俗称“羊口疮”）是由痘病毒科，副痘病毒属羊传染性脓疱病毒（Orf virus,ORFV）引起的一种人畜共患传染病。该病主要危害3～6月龄羔羊和部分成年羊，临床症状表现为嘴唇、口黏膜部分皮肤红疹、脓疱、溃疡和结痂；羔羊表现为齿唇部破溃，不能吃奶，若继发或混合感染其他病原微生物死亡率较高。本病可以通过伤口感染饲养人员表现为手背、指间和前臂部疱疹和破溃。该病世界范围内发生且广泛流行，因此，羊传染性脓疱的爆发和流行不但严重危害羊产业的健康发展而且威胁人们的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。

临床上尚无有效的药物用于羊传染性脓疱病的防治，疾病处于自限性时，通常使用抗生素阻止细菌继发感染;处于并发症时，常使用局部冷敷疗法或切除法；疾病较为严重时，可进行必要的切除进行治疗。目前，用于生产羊口疮疫苗的毒株是在20年前制备的，随着病毒的变异，保护效率不高。更为严重的是由于羊口疮疫苗制作工艺复杂，市场需求量较其他动物疫苗小等原因，很多动物疫苗企业不愿意进行羊口疮疫苗的生产，导致市场上无羊口疮疫苗供应。因此急需一种制作简单能够预防羊口疮的新型疫苗来进行羊口疮的防控。

随着养羊业规模化的快速发展，羊传染性脓疱危害越来越严重，如何提高疫苗的免疫保护效率、降低生产成本、简化免疫程序等成为迫切需要解决的问题，开发研制一种安全、高效、经济、实用的新型疫苗对羊传染性脓疱病的防治意义重大。B2L基因编码42kDa的蛋白，该蛋白是病毒囊膜的成分之一，可刺激机体产生强烈的抗体反应，并刺激淋巴细胞释放（是羊口疮病毒的保护性抗原之一，诱导的免疫反应足以抵抗强毒的攻击。真核表达载体PVAX1是在PcDNA3.1的基础上开发的具有CMV启动子和BGHpoly(A)信号序列，通过了食品与药物管理局批准的可用于DNA疫苗研究的载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够有效用于羊传染性脓疱病的防治的新型疫苗，本发明的疫苗不仅具有高的免疫保护效率，而且具有生产成本低，可大规模生产的特点，能基本满足当前对于羊传染性脓疱病的防治的需要。

为达到本发明所述的目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体，其特征在于所述的载体是通过将羊传染性脓疱病毒的主要免疫原性基因B2L基因插入到真核表达载体pVAX1内构建得到的。

所述的用于基因疫苗的真核表达载体pVAX1是常用的基因疫苗载体，其特征是在其多克隆位点上游引入人巨细胞病毒的立即早期启动子序列，在其多克隆位点下游引入可以有效终止转录和mRNA聚腺苷酸化的牛生长因子（BGH）聚腺苷酸化信号序列，真核表达载体pVAX1的载体图谱如图1所示。

在本发明中，优选的，所述的B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于含有本发明所述的DNA疫苗载体。

在本发明中，优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌DH5α。

再进一步的，本发明提供了一种构建以上所述的DNA疫苗载体的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据B2L基因完整编码区设计一对引物，上下游引物P1和P2分别引入BamH Ⅰ（GGATCC）和Xho Ⅰ（CTCGAG）酶切位点，所述的引物序列如下所示：

上游引物P1：TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC

下游引物P2：TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC

（2）用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊传染性脓疱病毒DNA为模板，扩增B2L基因，电泳检测并纯化回收该片段；

（3）将步骤（2）得到的片段与pVAX1载体分别用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行酶切，分别获得带有粘性末端的B2L基因片段和PVAX1质粒片段；

（4）将步骤（3）得到的两段片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确后，通过小量提取或大量提取制备得到所述的DNA疫苗载体。