[发明专利]双相柱膜蛋白质微反应器及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种双相柱膜蛋白质微反应器，可实现膜蛋白质原位富集、pH置换、还原、烷基化、酶解的样品预处理过程，并且与分离、检测系统联用，即可实现对膜蛋白质酶解产物的分离、鉴定。

背景技术

细胞膜是细胞对外界的屏障和细胞内外物质交换的枢纽，它将细胞与周围环境隔离开，维持细胞内环境的稳定。细胞膜蛋白质组对执行细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号传导和调控以及能量传递等功能起着重要作用。真核生物中1/3的蛋白均整合在膜上。膜蛋白质在药物研究中也起着相当重要的作用，在已知的和正在研究的药物靶标中大约有70％为膜蛋白质。然而，由于膜蛋白质疏水性强，导致其溶解性和酶解效率较差，对目前通用的蛋白质组学技术提出了挑战。

甲酸是一种很好的膜蛋白质增溶剂，后续的酶解通常采用化学裂解剂溴化氰或酸性胃蛋白酶。然而，溴化氰是一种剧毒试剂，且只能在甲硫氨酸处裂解，产生的肽段较大，不利于质谱检测。胃蛋白酶是一种非特异性的蛋白质水解酶，因此在质谱数据检索时，产生的理论酶切肽段列表太大，对用于数据检索的服务器要求高，数据检索时间过长，数据检索的假阳性率高，严重地影响了膜蛋白质的鉴定。胰蛋白酶专一性强，酶切后得到的肽片段大小适中，分子质量在500-3000Da之间，非常适合质谱的检测范围，是蛋白质鉴定中应用最多的蛋白水解酶。因此，将甲酸的强溶解能力和胰蛋白酶的特异性酶切相结合，对于膜蛋白质分析有着重要意义。

目前，有文献通过将甲酸溶解后的膜蛋白质溶液，用碳酸氢铵调节pH至pH=8后，进行后续的蛋白质的酶解（Cruz,S.D.,Xenarios,I.,Langridge,J.,Vilbois,F.,Parone,P.A.,Martinou,J.C.,J.Biol.Chem.2003,42,41566 41571.）。这种方法的问题在于：一、操作不方便；二、膜蛋白质的浓度被严重稀释；三、酸、碱性置换过程易造成膜蛋白质的再次析出；四、离心管内进行操作，内壁吸附损失较大；五、无法实现在线分析。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于发展一种双相柱膜蛋白质微反应器（图1），通过该微反应器富集膜蛋白质样品，在不稀释样品的前提下，便捷、高回收率、原位地实现膜蛋白质样品所处环境酸、碱性的置换，确保酸性条件下溶解和碱性条件下酶解的兼容（图2）。此外，该样品预处理过程均在毛细管柱原位进行，可实现膜蛋白质样品预处理的在线、自动化操作。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

双相柱膜蛋白质微反应器：

包括中空的容器，于中空的容器内顺次填充阴离子交换材料、阳离子交换材料、或顺次填充阳离子交换材料、阴离子交换材料，于中空的容器内部空腔的一端或两端设置有柱塞；所述中空的容器为圆柱、圆锥或圆盘形容器，中空容器的内部空腔径向横截面直径为50μm-5cm。

容器为：20-1000μl移液器枪头，1-20ml固相萃取（SPE）管，1-20ml注射器针管，50-500μm内径毛细管或注射器滤膜腔体。

柱塞是在微反应器内原位合成的整体柱柱塞或孔径为3nm-20μm的筛板。

同一容器内包含阴离子交换材料、阳离子交换材料；

阳离子交换材料为含有磺酸基团和/或磷酸基团的强阳离子交换材料、或含有羧基基团的弱阳离子交换材料；阴离子交换材料为含有季铵基团的强阴离子交换材料、或含有仲胺和/或叔胺基团的弱阴离子交换材料；材料可以是颗粒材料或者整体材料。

阳、阴离子交换材料的搭配可以是：强阳离子交换材料和强阴离子材料；强阳离子交换材料和弱阴离子交换材料；弱阳离子交换材料和强阴离子交换材料；弱阳离子交换材料和弱阴离子交换材料。

所述双相柱膜蛋白质微反应器的应用：

1）在带有柱塞的横截面直径为50μm-5cm的圆柱、圆锥或圆盘形容器内顺次填充阴、阳离子交换材料或阳、阴离子交换材料；

2）采用pH为1-7的酸性溶液或pH为大于7-14的溶有质量或体积浓度为1％-30％的表面活性剂或去垢剂的碱性溶液溶解膜蛋白质样品，将样品溶液通过微反应器实现膜蛋白质的原位捕集；

3）然后，通入pH为大于7-14的碱性溶液或pH为1-7的酸性溶液进行微反应器内溶液体系的pH值的置换；

4）之后，用还原剂进行蛋白质的还原，随后用烷基化试剂进行蛋白质的烷基化处理，最后在pH为大于7-14的碱性条件下进行蛋白质的酶解或pH为1-7的酸性条件下进行蛋白质的酶解；