[发明专利]双相柱膜蛋白质微反应器及其应用

权利要求书

1.双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于：

包括中空的容器，于中空的容器内顺次填充阴离子交换材料、阳离子交换材料、或顺次填充阳离子交换材料、阴离子交换材料，于中空的容器内部空腔的一端或两端设置有柱塞；所述中空的容器为圆柱、圆锥或圆盘形容器，中空容器的内部空腔径向横截面直径为50μm-5cm。

2.根据权利要求1所述的双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于：容器为：20-1000μl移液器枪头，1-20ml固相萃取（SPE）管，1-20ml注射器针管，50-500μm内径毛细管或注射器滤膜腔体。

3.根据权利要求1所述的双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于：柱塞是在微反应器内原位合成的整体柱柱塞或孔径为3nm-20μm的筛板。

4.根据权利要求1所述的双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于：同一容器内包含阴离子交换材料、阳离子交换材料；

阳离子交换材料为含有磺酸基团和/或磷酸基团的强阳离子交换材料、或含有羧基基团的弱阳离子交换材料；阴离子交换材料为含有季铵基团的强阴离子交换材料、或含有仲胺和/或叔胺基团的弱阴离子交换材料；材料可以是颗粒材料或者整体材料。

5.根据权利要求1或4所述的双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于：阳、阴离子交换材料的搭配可以是：强阳离子交换材料和强阴离子材料；强阳离子交换材料和弱阴离子交换材料；弱阳离子交换材料和强阴离子交换材料；弱阳离子交换材料和弱阴离子交换材料。

6.一种权利要求1所述双相柱膜蛋白质微反应器的应用，其特征在于：

1）在带有柱塞的横截面直径为50μm-5cm的圆柱、圆锥或圆盘形容器内顺次填充阴、阳离子交换材料或阳、阴离子交换材料；

2）采用pH为1-7的酸性溶液或pH为大于7-14的溶有质量或体积浓度为1％-30％的表面活性剂或去垢剂的碱性溶液溶解膜蛋白质样品，将样品溶液通过微反应器实现膜蛋白质的原位捕集；

3）然后，通入pH为大于7-14的碱性溶液或pH为1-7的酸性溶液进行微反应器内溶液体系的pH值的置换；

4）之后，用还原剂进行蛋白质的还原，随后用烷基化试剂进行蛋白质的烷基化处理，最后在pH为大于7-14的碱性条件下进行蛋白质的酶解或pH为1-7的酸性条件下进行蛋白质的酶解；

5）酶解完成后，用200-2000mM的盐溶液将膜蛋白质的酶解肽段从微反应器上洗脱下来，收集洗脱液，用液相色谱法分离，质谱、紫外或荧光检测器进行检测。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：pH为1-7的酸性溶液可为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；

表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、chaps、Rapigest SF、或NP-40d；去垢剂可为尿素、硫脲、或盐酸胍；

pH为大于7-14的碱性溶液可为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；

溶解蛋白质的溶剂可以是pH为1-7的酸性溶剂，也可以是pH为大于7-14的碱性溶剂；

如果是酸性条件下捕集，则填装顺序为：载流液流入端为阳离子交换材料，载流液流出端为阴离子交换材料；

如果是碱性条件下捕集，则填装顺序为：载流液流入端为阴离子交换材料，载流液流出端为阳离子交换材料。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：若在酸性条件下捕集，则用pH为大于7-14的碱性溶液置换pH值，溶液浓度范围在1-100mM之间；

若在碱性条件下捕集，则用pH为1-7的酸性溶液置换pH值，溶液浓度范围在1-100mM之间。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、磷酸三氯乙酯（TCEP）或β-巯基乙醇；浓度为1-200mM；

烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺；浓度为1-200mM；

pH为大于7-14的碱性条件下进行蛋白质的酶解选择胰蛋白酶、内肽酶Arg-C、内肽酶lys-C、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶中的一种或几种；用量为蛋白质样品质量的1/100-1/10；

pH为1-7的酸性条件下进行蛋白质的酶解选择胃蛋白酶或溴化氰试剂；用量为蛋白质样品质量的1/100-1/10；盐溶液为碳酸氢铵溶液、氯化钠溶液、乙酸铵溶液、磷酸盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：膜蛋白质捕集于微反应器后，后续的膜蛋白质的还原、烷基化、酶解过程均在微反应器内原位进行。