[发明专利]原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用，特别是治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用。 

背景技术：

原蛋白转化酶（Subtilisin-like Proprotein Convertases，SPCs或PCs）是一类蛋白内切加工酶，它们介导了与胚胎形成、基因表达、细胞周期、凋亡和神经内分泌等功能活动的相关前体蛋白的加工和成熟。这些前体蛋白分子的成熟需要涉及多个加工酶的分子加工步骤。目前，这些属于丝氨酸蛋白酶家族的原蛋白转化酶有PC1（或PC1/3），PC2，PC4，Furin，PACE4，PC5/6，PC7，SKI-1和PCSK9等9种。它们在脊椎动物功能细胞中单独或共同表达，在时间和空间上起作用。已经证实，哺乳类原蛋白转化酶与许多疾病相关，如癌症、脑卒中、青光眼等。原蛋白转化酶2（PC2）广泛地表达在内分泌组织中，在原蛋白加工成熟中伴有基础的角色。Tanaka S等和Sang-Nam L等报道，在高Ca²⁺、pH5.0和其它原蛋白转化酶存在下，鼠PC2原蛋白（proPC2，637aa/74kDa)裂解成成熟的PC2酶(529aa/64kDa)。在这个加工成熟过程中，proPC2蛋白分子的正确折叠需其分子伴侣7B2蛋白（21kDa）的帮助。文献报道，在人pc2基因（1914bp/638aa）和小鼠pc2基因（1911bp/637aa）之间有96.55%同源性；在大鼠和小鼠之间，pc2基因有99.53%同源性，这显示：pc2基因在人和鼠之间有极高度保守性。PC2是内肽酶，许多文献报道，前体蛋白的成熟需要PC2作用。神经内分泌肽前体蛋白到成 熟通常有三种形式，带有信号肽的前原蛋白（pre-pro-protein），原蛋白（pro-protein）和成熟肽。这些加工过程是由信号肽酶和PCs系统起作用。 

发明内容：

本发明的第一个目的是提供原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用，特别是在制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用。 

本发明所述的原蛋白转化酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明的第二个目的是提供原蛋白转化酶2在制备治疗癌症药物中的应用，特别是在制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用，所述的原蛋白转化酶2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2的第109~637位所示。 

本发明的第三个目的是提供编码原蛋白转化酶2的基因在制备治疗癌症药物中的应用，特别是在制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用。 

所述的编码原蛋白转化酶2的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第325~1911位所示。 

本发明将原蛋白转化酶2基因和7b2基因分别插入表达载体pCDNA3.1中，形成表达载体pCDNA3.1-pc2和pCDNA3.1-7b2。将重组细菌培养，重组质粒用通用的DNA纯化试剂盒抽提后，通过脂质体介导将pCDNA3.1-pc2和pCDNA3.1-7b2重组质粒共转染人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF、小鼠乳腺癌细胞4T1和小鼠黑色素瘤细胞B16。应用MTT法测定pc2重组质粒对上述癌细胞的半数起效量IC50分别为94.20、0.02、8.11、1.39和2.23（μg/50μl）。由此可见本发明的原蛋白转化酶2基因对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF、小鼠乳腺癌细胞4T1和小鼠黑色素瘤细胞B16具有较好的抑制作用，这 显示，pc2基因对人和鼠癌症有同样的效果。因此可以将原蛋白转化酶2基因用于制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或黑素瘤等癌症药物中。 

再通过脂质体介导，将质粒pCDNA3.1-pc2和pCDNA3.1-7b2基因共转染小鼠乳腺癌细胞株4T1，结果显示，转染小鼠乳腺癌细胞株4T1具有最高的PC2酶活性和明显的PC2蛋白表达。转染48小时后，培养液中出现大量的悬浮细胞，与相同细胞密度的转染空载体pCDNA3.1的瘤细胞比较，共转染组贴壁细胞明显减少，不同密度瘤细胞的共转染引起相同的凋亡现象。贴壁细胞荧光染色（DAPI）显示，部分癌细胞核裂解成碎块和TUNEL反应阳性，显示有明显细胞死亡。