[发明专利]一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法。

背景技术

在化工领域中，乙醇(俗称酒精)是一种重要的工业原料，广泛应用于化工、食品、饮料工业、军工、日用化工和医药卫生等领域，并且乙醇作为一种优良的燃料(其燃烧值达到26900 kJ/kg)，可以提高燃油品质口。如今，在发酵行业中，主要采用酿酒酵母生物转化生产乙醇。

固定化细胞技术根据固定化方法大致分为吸附法、包埋法、共价法和交联法，其中以包埋法应用最为普遍。载体是固定化细胞技术的核心部分。包埋法中的载体有多种，如聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、角叉菜聚糖、琼脂糖、明胶等。目前固定化细胞技术已成为国际上研究的热点之一，广泛应用于工业、医学、环境保护、能源开发及化学分析等诸多领域。

海藻酸钙是迄今应用最为广泛的一种固定化载体。它具有网格孔隙大、传质阻力小、制备方法简单及价格低廉等优点。但其强度较差，使用寿命短。这主要是由于培养基中的磷酸盐逐渐使海藻酸钙凝胶破裂和解体。延长海藻酸钙凝胶使用寿命的处理方法较多。

发明内容

本发明提供了一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法，本发明以树干毕赤酵母为出发菌株，利用海藻酸锰凝胶代替海藻酸钙，固定化酵母使用寿命明显增加。

1.      一种利用树干毕赤酵母固定化细胞发酵乙醇的方法，其特征在于发酵时，将固定化凝胶球用无菌水洗3次后，移入发酵培养基中。发酵容器为250 mL三角瓶，发酵液体积与凝胶球的堆积体积之比为3：2，其中发酵液体积为50 mL，总体积为80 mL；将三角瓶置于恒温振荡器中，在35℃、150 r/min条件下进行乙醇发酵。

2.      步骤1所述的固定化细胞的制备与增殖方法为：将试管斜面菌种接入液体酵母细胞培养基，在30℃ 、150 r/min条件下活化2 d，取2 mL菌液与海藻酸钠溶液(68 mL)于常温下混合，注入2% CaCl₂水溶液中，固化4 h，用无菌水将固化后的海藻酸钙凝胶球(直径2～3 mm)洗3次(每次50 mL)，移入1.2% MnSO₄溶液中，放置冰箱(4℃)固化24 h。将固定化好的凝胶球(直经约3 mm)置于增殖培养基中，在30℃、150 r/min条件下增殖培养，12 h更换一次新鲜培养液，共增殖4次。

3.      步骤1所述的发酵培养基为葡萄糖30.0 g/L，木糖30.0 g/L，CaC1₂ 2.5 g/L，MgSO₄ 0.25 g/L，KH₂PO₄ 2.5 g/L，培养基pH 5．0。

4.      步骤2所述的固定化增殖培养基为：葡萄糖30.0 g/L，木糖30.0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，酵母汁2.5 g/L，CaC1₂ 2.5 g/L，MgSO₄

0.25 g/L，KH₂PO₄ 2.5 g/L，培养基pH 5.0。

5.      步骤2所述的酵母细胞培养基为:木糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母汁3.0 g/L，培养基pH 5.0。

6.      步骤2所述的海藻酸锰、海藻酸铝的固定化细胞耐磷酸盐能力提高3倍。

7.      步骤2所述的当MnSO₄溶液质量分数为1.3%时，形成的海藻酸锰固定化酵母进行乙醇发酵最佳。 

8.      步骤2所述的当pH 为5.5时海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵较适宜。

9.      步骤2所述的海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵要比海藻酸铝固定化细胞乙醇发酵稳定时间长6 d。

本发明利用Mn²⁺对Ca²⁺置换法，将低浓度的树干毕赤酵母细胞固定，通过增殖培养，能高效地同步发酵戊糖和己糖，形成的海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力显著增强，其使用寿命显著增加。为固定化细胞乙醇发酵的工业化生产提供理论依据。

附图说明

图1 MnSO₄溶液质量分数对固定化细胞乙醇发酵糖利用率的影响。

图2海藻酸钙、海藻酸铝、海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。