[发明专利]荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途

说明书

技术领域

本发明属于药物筛选方法领域，涉及一种荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，尤其涉及应用磁珠分离和液相色谱-质谱联用定性从荷叶中筛选得到具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，并在制备治疗糖尿病药物中的应用。

背景技术

糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，其主要的干预方法是控制饮食、减少摄入性碳水化合物的含量、药物治疗等。人体摄入的碳水化合物经过小肠上皮细胞的酶（如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收进入血液循环。阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制α-葡萄糖苷酶，减少碳水化合物转化成葡萄糖，是一类临床常用的糖尿病治疗药物。现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法主要采用体外酶活性抑制实验，仅能对纯化合物的活性进行评价，难以用于中药等复杂混合物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的发现。

亲和选择技术联用质谱分析方法可以快速分析与鉴定与特定蛋白或酶结合的配体化合物，如将特定蛋白或酶加入待筛选的样品中使用超滤膜把蛋白结合物与未结合的化合物分离开，再进行质谱检测；或是把特定蛋白或酶固定在色谱固定相中，使用洗脱溶剂把化合物按照与蛋白的结合强弱依次洗脱下来，进行质谱检测；还可将特定蛋白或酶固定在某种合适的载体上，与配体化合物作用后，把不结合的化合物洗脱掉，然后把与酶结合的化合物洗脱出来，进行质谱检测。

发明内容

本发明的目的是提供荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，是利用磁珠分离联用液质定性的快速筛选方法获得，通过以下步骤实现：                                                将空白羧基磁珠用1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液活化；在活化磁珠中，加入α-葡萄糖苷酶溶液及2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，振荡孵育一段时间后使α-葡萄糖苷酶键合于空白羧基磁珠上；对酶键合磁珠进行电镜分析、磁力测试和红外分析考察键合磁珠质量；在酶键合磁珠中加入荷叶提取物水溶液，振荡孵育一段时间后，移去孵育液，将α-葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱液进行液质联用定性分析，筛选获得具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物；分离制备化合物并进行α-葡萄糖苷酶抑制活性验证。

具体的步骤如下：

1. 制备键合α-葡萄糖苷酶的磁珠

（1）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（2）磁珠键合：在活化的磁珠上，加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30min进行包被，移去上清液，再用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗包被的磁珠4次，弃去清洗液，待用。

（3）键合磁珠质量考察  将制备的键合磁珠分散在PBS溶液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别分析，检查酶键合情况。采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、α-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况。采用磁强计数仪考察键合磁珠的磁力变化情况。

2. 筛选具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物

（1）具潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛：取100 μl荷叶提取物水溶液2份，分别加到1ml 分散于醋酸铵溶液的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，放在振荡器上混匀，孵育1 h。弃去上清液，再加入1ml醋酸铵溶液清洗2次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈的醋酸铵溶液洗脱，吸取洗脱液备用，平行操作三份，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析。

（2）目标化合物获取及活性验证

采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置目标化合物标准品

采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。

本发明提供的荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的结构通式如下：