[发明专利]鉴别毛蜂窝菌（龙眼梳）的特征性核苷酸序列及其探针和方法

说明书

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域，具体涉及用于鉴别毛蜂窝菌（即龙眼梳，Hexagonia apiaria）的特征性核苷酸序列以及核苷酸分子探针和鉴别毛蜂窝菌的方法。

背景技术：

毛蜂窝菌[Hexagonia apiaria(Pers.)Fr.]，又名龙眼梳，隶属于非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科（Polyporaceae）、蜂窝菌属（Hexagonia），子实体在腐木上侧生，无柄，扁平，平展至平展反卷，肾形至近半圆形，韧木栓质，菌盖长5～11.5cm，宽4～6cm，厚0.7～1.5cm，黄褐色至灰黑色，被分枝或不分枝的黑色硬粗毛，老熟后部分易脱落，具环纹和辐射状皱纹，边缘薄而锐。菌管表面灰白色、淡黄褐色至赤褐色；菌孔幼时六角形，管口呈蜂窝状，直径1～4mm，孔内灰白色，成熟后不规则形；菌肉棕褐色至锈褐色，厚0.2～0.4mm。在我国主要分布于广东、海南、广西、四川、贵州、云南、福建、台湾、香港等地区。毛蜂窝菌是一种珍稀的药用真菌，据《中华本草》记载，毛蜂窝菌微苦、涩、微温，具理气止痛、健胃之功效。中医上常利用毛蜂窝菌子实体干品10～12克煎汤温服治疗胃病、也有与裂蹄菌、桦褐孔菌、灵芝等混合，加工成超微粉，用温水冲服辅助治疗胃癌；中医上还有用毛蜂窝菌子实体水煎服用治疗慢性肾炎；在广东民间，曾有肾结石患者煎服毛蜂窝菌子实体有排石效果的案例。

毛蜂窝菌在药用及保健方面的开发利用具有广阔前景，但在自然界，由于受生长环境和季节等条件的限制，野生资源较为稀有，不易获得，且采收的成本较高，品质参差不齐，同时也常常发生将灵芝、桑黄、拟层孔菌等木生真菌当作毛蜂窝菌的现象，不利于毛蜂窝菌作为医药保健品的开发和利用。近年来，毛蜂窝菌的人工栽培已获成功，同时带动了毛蜂窝野生资源的开发利用。

DNA是生物储存遗传信息的物质，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，可以作为该生物物种或个体区别于其他物种或个体的标志。DNA是细胞生物的基本组成部分，作为遗传信息的载体，具有一定的稳定性，不会受表型的影响而改变，是用来鉴别物种、个体的可靠依据，特别对于原料检测等已无法进行形态鉴定的情况特别有效。通过生物信息学的分析可以找到不同物种或个体的特征性核苷酸序列，利用分子生物学的手段对该序列进行探测即可快速、准确的对物种或个体进行鉴别。目前，未见与毛蜂窝菌相关的核苷酸特征性序列的专利。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供来源于毛蜂窝菌（Hexagonia apiaria）核糖体rRNA内转录间隔区ITS1、ITS2以及5.8S rRNA基因，用于鉴别毛蜂窝菌的特征性核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的利用分子生物学手段鉴别毛蜂窝菌的特征性核苷酸序列来源于毛蜂窝菌核糖体rRNA内转录间隔区ITS1、ITS2以及5.8S rRNA基因（核糖体rRNA内转录间隔区ITS1、ITS2以及5.8S rRNA基因合并简称ITS区），其序列如SEQ ID NO.1所示，所在位置以及特征见图1，该序列包含毛蜂窝菌的ITS1、5.8S rDNA以及ITS2的序列。该序列可通过实施例1所述的方法获得，亦可通过人工合成的方法在商业化的DNA合成仪器上按照发明人提供的核苷酸序列合成。

本发明以上述毛蜂窝菌的特征性核苷酸序列（如SEQ ID NO.1所示）为模板而设计得到全长序列或不少于16个核苷酸组成的寡核苷酸序列，以及在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上经修饰、加工、变化而获得核苷酸序列，也包括在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上在5’端添加或改变10个核苷酸以下或改变原有核苷酸序列数量小于10%以及3’端6个核苷酸改变不足1个核苷酸的核苷酸序列作为毛蜂窝菌鉴定的专一性核苷酸分子探针。上述序列可通过DNA自动合成仪等DNA合成装置按照设计好的顺序合成而获得，并可以通过酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等方式进行标记。