[发明专利]一种测定生鲜冷却牛肉中生物胺的方法

说明书

技术领域

本发明属于化学分析领域，特别涉及生鲜冷却牛肉中6种常见生物胺的测定方法。

背景技术

牛肉营养丰富，是深受人们喜爱的肉制品之一，其高营养高水分的特点使之成为极易腐败的食品。微生物的生长繁殖是导致腐败变质的主要原因，腐败产物主要是生物胺。

生物胺是一类由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的低分子含氮有机化合物的总称，包括脂肪族（腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等）、芳香族（酪胺、苯乙胺等）和杂环族（组胺、色胺等）。八种常见生物胺的化学结构如下。

微量生物胺是生物体内的正常活性成分，在调节生长、代谢、控制血压、消除自由基等方面具有显著作用。适量的生物胺摄入对人体健康有益，但当积累到一定程度时便会产生毒性作用，引起呼吸紊乱、腹泻、头痛等症状。

食品基质复杂，有必要研究各类食品中生物胺的检测方法。目前红酒、香肠、奶酪、鱼类等食品中生物胺的检测方法报道较多，但牛肉中生物胺的检测方法鲜有报道。

用于测定生物胺的方法主要有气相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、酶生物传感器法等。目前高效液相色谱法最为常用，方法回收率高、实用性强，但存在衍生条件苛刻、耗时长等缺点。已有国外学者选择HPLC-MS/MS方法检测了奶酪中的尸胺、组胺等7种生物胺，无需柱前衍生，且方法可靠、经济效益好，国内对此类方法的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，解决现有生物胺测定方法中前处理复杂、衍生耗时的问题。

本发明的技术方案是：一种生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，步骤包括：

I.前处理

（1）提取：取牛肉样品与三氯乙酸水溶液混合匀浆后提取2～3次，离心取上清液，合并得到上清液III；用正己烷萃取，取下层液体即为样品提取液；

提取方法为，牛肉样品与三氯乙酸水溶液混合匀浆后离心取上清液I；滤渣再与三氯乙酸水溶液混合进行第二次提取，取上清液；需要时再提取一次，所得到的上清液与上清液I合并得到上清液III；

优选的，每次提取中，牛肉样品与三氯乙酸水溶液用量比为1g：3～5ml，优选为1g：4ml；上清液III与正己烷体积比为1：0.8～1.2，优选为1：1；所述的三氯乙酸水溶液浓度为4wt%～6wt%，优选为5wt%；

（2）净化：步骤（1）的样品提取液过混合型阳离子交换固相萃取柱，洗脱后取洗脱液干燥，溶解于乙腈甲醇溶液，并过滤；具体步骤为，混合型阳离子交换固相萃取柱活化后，取步骤（1）的样品提取液上柱，用水和醇依次洗涤后用氨水甲醇溶液洗脱；洗脱液吹干后加入乙腈甲醇溶液混合均匀，过滤；氨水甲醇溶液中，氨的体积浓度为4%～6%，优选为5%；

II.HPLC-MS/MS测定

（A）色谱条件为：选用亲水作用色谱柱（如Atlantis HILIC）；流速：0.15～0.3mL/min，优选0.2mL/min；进样量：8～12μL，优选10μL；分析时间：12～15min，优选15min；柱温：35℃；流动相：A相为水相(乙酸铵和甲酸的水溶液，其中乙酸铵含量1.5～2.5mmol/L,优选2mmol/L，甲酸含量0.05wt%～0.15wt%，优选为0.1％)，B为乙腈；

梯度洗脱条件：水相的体积百分比变化为：0～5min，由30%匀速变为60%；5～8min为洗脱，60%；8～8.1min，由60%变为30%；8.1～15min为平衡，水相30%；

（B）质谱条件：离子源温度116～122℃，优选离子源温度120℃，优选采用电喷雾离子源(ESI)；脱溶剂温度295～310℃，优选300℃；脱溶剂气和锥孔气N₂，脱溶剂气流速450～520L/h，优选500L/h；锥孔气流速48～53L/h，优选50L/h；碰撞气体为氩气；毛细管电压为2.80～3.20kV，优选为3.00kV；扫描方式为正离子扫描，驻留时间45～60ms，优选为50ms，监测模式为MRM（多反应监测）模式。

外标法进行质谱定量分析，根据酪胺、组胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺混合物的标准曲线，检测生鲜牛肉中的生物胺含量；还可采用加标的方法进行检测。