[发明专利]维生素B12化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的涉及维生素B12（VB12）化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

维生素B12（vitamin B12，VB12）又叫钴胺素，是一种含钴的维生素，是所有具有氰钴胺素生物活性的类咕啉的总称，自然界中的VB12都是微生物合成的，高等动植物不能制造VB12，VB12是需要一种肠道分泌物（内源因子）帮助才能被吸收的唯一的一种维生素。另外，维生素B12也是唯一含必须矿物质的维生素，因含钴而呈红色，又称红色维生素，是少数有色的维生素。VB12属B群维生素，贮存量很少，约2~3mg在肝脏。人体维生素B12需要量极少，只要饮食正常，就不会缺乏。主要从尿排出，部分从胆汁排出。

其主要生理功能包括：①提高叶酸利用率，缺乏VB12时，从甲基四氢叶酸上转移甲基基团的活动减少，使叶酸变成不能利用的形式，导致叶酸缺乏症。②维护神经髓鞘的代谢与功能。缺乏VB12时，可引起神经障碍、脊髓变性，并可引起严重的精神症状。VB12缺乏可导致周围神经炎。小孩缺乏VB12的早期表现是情绪异常、表情呆滞、反应迟钝，最后导致贫血。③促进红细胞的发育和成熟。将甲基丙二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A，参与三羧酸循环，其中琥珀酰辅酶A与血红素的合成有关。④参与脱氧核酸（DNA）的合成，脂肪、碳水化合物及蛋白质的代谢，增加核酸与蛋白质的合成。

维生素B12为机体维持正常代谢、DNA合成和红细胞再生所必需。维生素B12缺乏得不到及时纠正可导致巨幼细胞贫血及不可逆性中枢神经系统损伤。维生素B12或叶酸测定对查明维生素B12、叶酸缺乏有诊断价值,尤其对巨幼细胞贫血的鉴别诊断有意义诊断方法

目前临床上维生素B12定量检测常用方法有：

（1）放射免疫分析技术（RIA）：较早的临床定量检测方法，灵敏度高，特异性高，但因为有放射性污染，且操作繁琐，市场逐渐萎缩。

（2）酶联免疫分析法（ELISA）：RIA之后出现的分析方法，因操作简单，无放射性污染，价格较低，现在有一定的市场占有率，但ELISA灵敏度不如RIA。

化学发光免疫分析（CLIA）为当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高、稳定性好，无污染等优点，目前已广泛应用到基础医学和临床医学的各个领域，成为取代RIA的首选技术。化学发光免疫分析起步于80年代初，快速发展应用于90年代，主要特点是高敏感性、可测定浓度范围宽、样本无需稀释即可检测、试剂有效期长、操作简单、检测自动化成度高、数据自动生成处理能力强、测定仪器兼容性好、无环境污染等，因而得到了迅速发展与应用。但目前使用化学发光方法检测VB 12的试剂盒还较少，临床应用较少。

发明内容

本发明要解决的问题是提供维生素B12（VB12）的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：VB12抗体包被板、VB12抗原酶结合物、VB12校准品、VB12质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液、样本处理液A液和B液。

所述的VB12抗体包被板为包被有VB12抗体的96孔或48孔白色微孔板，孔间平均变异（CV%）不高于10%。

所述的抗原酶结合物所用的酶为辣根过氧化物酶，纯度要求RZ≥3.0，活性≥250U/mL，购自Sigma公司。

VB12抗体来源于Fitzgerald公司，在外观上应澄清透明，无沉淀，纯度应≥90%，采用倍比稀释测定效价应不低于10⁵倍稀释，应确保VB12测定的灵敏度、特异性和稳定性。

所述的VB12质控品包括低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其中低值质控品的浓度范围是158.68～238.02pg/mL，高值质控品的浓度范围是1141.37～1712.05pg/mL。

所述的VB12化学发光免疫定量检测试剂盒，所述的发光液A液包含0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲水溶液。样本处理液A液包含36g/L NaOH；样本处理液B液包含10.66g/L MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸），1.03g/L DTT（二硫苏糖醇），1g/L Proclin300，pH5.5。

所述的20倍浓缩洗液包括75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300。